家蚕杆状病毒表达系统研制草鱼出血病病毒和禽流感病毒疫苗

【摘要】杆状病毒表达系统作为一个功能强大的表达载体已被广泛地应用于昆虫细胞中重组蛋白的表达及亚单位疫苗的开发，在哺乳动物细胞中，杆状病毒不能进行复制和转录，具较强安全性。含有非昆虫细胞的启动子（如CMV的启动子）的重组杆状病毒，可以有效地传递外源基因导入非昆虫细胞并实现外源基因高效表达。1．草鱼出血病病毒GCRVVP7蛋白亚单位/VP6DNA联合口服疫苗的制备及免疫效果评价将团头鲂（Megalobramaamblycephala）的β-肌动蛋白启动子控制的VP6蛋白基因克隆进杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中，同时将GCRV的另一结构蛋白VP7基因置于杆状病毒多角体蛋白（polh）基因启动子控制之下，构建双启动子控制双结构基因的蛋白—核酸疫苗表达载体pFastTMDual-VP7-VP6-β-actin，并获得重组杆状病毒Bacmid-VP7-VP6-β-actin，与刘林基于vp6单基因、徐诗英基于vp7单基因的蛋白/核酸联合口服疫苗不同，期望研制出能够高效对抗GCRV的草鱼疫苗。本研究利用杆状病毒表达系统在家蚕卵巢细胞及蚕蛹中进行GCRV结构蛋白VP7的表达，重组病毒感染家蚕卵巢细胞及蚕蛹120h后，分别收集细胞蛋白及蚕蛹蛋白，SDS-PAGE及Westernblotting检测结果显示，GCRVVP7蛋白成功在家蚕组织中特异性表达。蚕蛹感染重组杆状病毒120h后，冷冻干燥做成冻干粉，以5%的比例掺入饲料中，口服免疫鱼体。RT-PCR检测结果显示，在口服疫苗免疫组鱼体血液中能够检测到vp6基因的mRNA；此外免疫组化法在免疫组鱼体的肝脏、肾脏中和CIK细胞中可检测到VP6蛋白。结果表明，重组杆状病毒Bacmid-VP7-VP6-β-actin能够成功的进入鱼体，并表达VP6抗原基因。根据前期相关研究结论，预示蚕体表达的VP7蛋白可作为口服蛋白疫苗，同时也预示该重组病毒可作为vp6核酸疫苗。2.禽流感病毒多抗原表位在杆状病毒病毒中的表达为了探究禽流感病毒（AIV）抗原活性，本研究将赵翠青等人利用计算机预测出的T、B细胞复合表位盒氨基酸序列，参考家蚕密码子的偏爱性得到相应的核苷酸序列CTLT、THB。将CTLT、THB基因及CMV启动子克隆至pFastTM-Dual载体中，转化至DH10BacE.coli感受态中，获得重组Bacmid，经脂质体转染进BmN细胞，获得重组杆状病毒。采用PCR及WesternBlotting检测结果表明P10启动子驱动CTLT在家蚕细胞中表达，在重组病毒感染家蚕后，表达的CTLT有可能作为蛋白亚单位疫苗，而病毒DNA有可能作为THB的核酸疫苗。
【作者】李珍；
【导师】曹广力；贡成良；
【作者基本信息】苏州大学，遗传学，2014，硕士
【关键词】家蚕；杆状病毒表达系统；草鱼出血病病毒；禽流感；疫苗；

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