TM4基因通过Nur77-IKKβ-NF-κB通路抑制高脂诱导的代谢性炎症

【摘要】第一部分TM4基因真核表达载体及慢病毒表达载体的构建与鉴定目的：分别构建人四穿膜(TM4)基因与小鼠TM4基因的真核表达载体,及其慢病毒表达载体,为下一步TM4基因功能研究奠定基础。方法：1)分别以人TM4质粒、小鼠cDNA为模板,通过PCR扩增出人TM4基因[TM4(h)]与小鼠TM4基因[TM4(m)]的开放阅读框(ORF)；2)将TM4(h)、TM4(m)基因克隆到真核表达载体pcDNA中,并用酶切、测序证实插入的基因序列的正确性；3)进一步用pcDNA-TM4(h)、pcDNA-TM4(m)质粒转染HEK293细胞,RT-PCR以及western-blot方法证实质粒构建成功并且能够正确表达TM44)分别以慢病毒包装TM4(h)、TM4(m)表达载体,并经293TN细胞感染证实病毒包装成功；5)收集细胞上清,用梯度稀释法检测病毒滴度。用TM4(h)、TM4(m)’慢病毒分别感染THP-1细胞与3T3-L1细胞,确定最佳感染复数(MOI)值。结果：1)成功构建TM4(h)、(M4(m)l的真核表达载体pcDNA-TM4(h)、pcDNA-TM4(m),经鉴定证实序列正确,质粒转染细胞可以正确表达TM4蛋白。2)成功包装表达TM4(h)、TM4(m)基因的重组慢病毒载体,经细胞感染实验证实病毒包装成功。3)细胞上清液中的TM4(h)病毒滴度为1.56×104ifu/ul,TM4(m)病毒滴度为1.67×104ifu/ul。4)慢病毒感染THP-1细胞与3T3-L1细胞的最佳MOI值分别为8与18.4。结论：成功构建TM4(h)、TM4(m)真核表达载体及重组慢病毒载体。能在293TN细胞中正确表达,为后续实验奠定了基础。第二部分TM4负调控Nur77-IKKβ-NF-kB通路并能抑制高脂诱导的代谢性炎症目的：研究TM4对Nur77-IKKβ-NF-kB通路以及高脂诱导的慢性炎症的影响。方法：1)按照之前确立的最佳MOI,用增强绿色荧光蛋白(EGFP)标记的TM4(h)、TM4(m)重组慢病毒分别感染THP-1与3T3-L1细胞,两种细胞分别设立空病毒感染及空白对照。2)用终浓度1mM的软脂酸及油酸混合物(1：1)分别处理已感染慢病毒的THP-1与3T3-L1细胞。3)采用Real-timePCR及Westernblot检钡TM4、Nur77、IKKβ、NF-κBp65在mRNA与蛋白水平的表达差异。结果：1)慢病毒感染后96h,有绿色荧光蛋白表达的细胞数接近细胞总数的100%。Real-timePCR及Westernblot检测显示,感染TM4重组慢病毒后,TM4基因明显上调；2)Real-timePCR及Westernblot检测显示,对于THP-1细胞及3T3-L1细胞,高脂均能下调TM4表达,激活Nur77、IKKβ、NF-κBp65、TNF-α等炎症基因；3)TM4过表达,可明显下调Nur77、IKKβ、NF-κBp65、TNF-α的1nRNA水平及其蛋白表达,抑制高脂诱导的炎症激活。结论：TM4能负调控Nur77-IKKβ-NF-κB通路,抑制高脂诱导的代谢性炎症激活。第三部分TM4过表达能改善高脂喂养db/db小鼠的代谢性炎症与胰岛素抵抗目的：观察过表达TM4基因后db/db小鼠的表型变化。方法：将2周龄的雄性db/db小鼠30只随机分为3组(生理盐水、空病毒、TM4慢病毒),每组10只,喂以高脂饲料。3组小鼠每周经尾静脉分别注射生理盐水、空病毒、TM4慢病毒1次,每次lml,病毒液浓度为1×104ifu/ul.每周监测小鼠的体重、进食量、空腹血糖、尾动脉血压变化。饲养10周后(12周龄),腹腔注射葡萄糖检测小鼠糖耐量(IPGTT),次日将小鼠麻醉处死,取血检测血脂、空腹胰岛素、炎症因子；取骨骼肌、肝脏、附睾脂肪组织,行Real-timePCR及Westernblot检测TM4及其下游Nur77-IKKβ-NF-kB炎症通路表达水平,甲醛固定石蜡包埋观察肝脏与附睾脂肪组织病理变化。结果：1)Real-timePCR及Westernblot显示：感染TM4(m)慢病毒的小鼠骨骼肌、肝脏、附睾脂肪组织中的TM4表达均明显上调；2)慢病毒干预10周后,TM4过表达组db/db小鼠的HOMA-IR、空腹血糖、空腹胰岛素、体重、收缩压、平均压、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平显著低于对照组,而进食量无显著差异；3)糖耐量试验显示：TM4过表达小鼠的Omin,30min,60min,120min血糖及IPGTT曲线下面积均显著低于对照组；4)组织HE染色显示：对照及空病毒组小鼠肝细胞内有大量脂滴形成,呈明显脂肪肝表现,而TM4过表达组肝细胞未见明显气球样变；TM4过表达组小鼠的附睾脂肪细胞体积小于对照及空病毒组；5)TM4过表达组db/db小鼠骨骼肌、肝脏、附睾脂肪组织中的Nur77、IKKβ磷酸化NF-kB的表达均明显下调,血清炎症因子(TNF-α、IL-1β、MCP-1)水平显著低于对照组。结论：TM4过表达能改善高脂喂养db/db小鼠的代谢性炎症与胰岛素抵抗,这可能源于TM4对Nur77-IKKβ-NF-kB炎症通路的抑制。
【作者】陈立立；
【导师】胡仁明；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】TM4基因；真核表达载体；慢病毒载体；细胞转染；细胞感染；炎症；高脂；THP-1细胞；3T3-L1细胞；db/db小鼠；糖尿病；肥胖；胰岛素抵抗；

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