白纹伊蚊中肠特异性高表达miRNA-miR-281对登革病毒复制的调节作用

【摘要】背景：登革热是全球蔓延最快的虫媒传染病之一。根据世界卫生组织(WHO)2009年的统计数据显示,在过去50年,登革热的发病率增加了30倍。与此同时,其流行区域仍在不断扩大：截止目前,已波及全球100余个国家和地区。其中,主要的流行区集中于非洲、南美洲、东南亚和西太平洋地区。近10年,登革热的流行区域还从城市扩大到了广大农村。据估计,全世界每年约有5000万人感染登革热,2.5亿人面临登革感染的威胁。随着全球气候变暖、国际贸易和交流的增加、虫媒分布区域的扩大,城市化和人口增长迅速等因素多重影响下,登革的流行范围和频率还有不断加剧的趋势。在中国,自20世纪90年代以来,除海南、福建、浙江和江苏省有登革热爆发外,我国的登革热主要在广东省流行。登革热的病原体是登革病毒。登革病毒(denguevirus,DENV)是最重要的虫媒病毒之一,在分类学上属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)家族成员。登革病毒的基因组为单股正义RNA,全长～11kb,含单一开放读码框(openreadingframe,ORF),编码一个～3400个氨基酸残基的多聚蛋白前体。此多聚蛋白前体在翻译或翻译后水平被进一步加工生成成熟的登革病毒的3个结构蛋白(capsid,C,membrane,M,envelope,E)与7个非结构蛋白(NS1.NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,NS5).登革病毒基因组5’和3’端分别为序列高度保守的5’非编码区(untranslatedregion,UTR)和3’非编码区。登革病毒按照其抗原性分为5个血清型：DENV1～DEN-5。同个血清型下可分为不同的基因亚型。登革病毒主要经埃及伊蚊(Aedesaegypti,A.aegypti)和白纹伊蚊传播(Aedesalbopictus,A.albopictus)。在中国大陆,白纹伊蚊是主要的传播媒介,对登革1～4型病毒均具有高度易感性。分布于我国热带及亚热带地区,特别是南方沿海各省。媒介蚊虫在摄取病毒血症期的病人血液后,在叮咬其他人完成病毒传播之前,在蚊体内,需经一个过大约7-14天的外潜伏期(extrinsicincubationperiod,EIP)。在外潜伏期期间,含有登革病毒颗粒的血餐沉积在中肠消化,病毒首先感染中肠上皮细胞。登革病毒克服中肠感染屏障(midgutinfectionbarrier,MIB)后,在中肠进行复制,并释放入蚊虫血淋巴腔,然后穿越中肠逃逸屏障(midgutescapebarriers,MEB)最终侵染唾液腺。一旦病毒到达唾液腺,蚊虫便具有感染性。此时,具有感染性的蚊虫可叮咬健康人类而使人感染登革病毒。人类对登革病毒普遍易感。人感染登革病毒后,根据临床表现的严重程度,临床上分为登革热(denguefever,DF)、登革出血热(denguehemorrhagicfever,DHF)、登革休克综合征(thedengueshocksyndrome,DSS)。其中,登革出血热及登革休克综合征病情凶险,病死率相对较高。尽管登革热的流行与传播已成为全球公共卫生面临的严峻挑战,造成各国的疾病经济负担。但是迄今为止,临床上尚无特异性的抗登革病毒治疗药物,亦无批准上市使用的登革疫苗。目前而言,蚊媒防控仍然是重要的手段。因此,深入研究媒介蚊虫与登革病毒相互之间的调控关系显得尤为重要。microRNA(miRNA)是近年来生命科学研究的热点领域之一。miRNAs是一类广泛存在于动物、植物、细菌、病毒等多种生物物种,长度为18-25nt的内源性单链非编码小RNA,其最早发现于秀丽隐杆线虫中。目前,根据miRNA数据库miRBase最新版本Virsion20.0收录数据显示：已收录206个物种的30424条成熟miRNA序列。miRNA经典的形成途径如下：动物的绝大部分miRNA在细胞核内首先主要由RNA聚合酶Ⅱ(RNApolymeraseⅡ,PolⅡ)转录生成长度约为80nt的初级转录产物：初级miRNA(primarymiRNA,pri-miRNA)。然后pri-miRNA在Pasha/DGR8的协同下,由核酸酶Drosha切割为3’端突出的,长度～60nt,具有茎环结构的前体miRNA(precursor-miRNA,pre-miRNA)。pre-miRNA经Exportin-5等分子将其转运出细胞核后进入在细胞质中,由Dicer将其加工成为22nt左右的miRNA和miRNA*双链复合体。最终双链复合体中的一条链成为成熟的miRNA,与包含有Argonautefamily(Ago)蛋白家族的RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)相结合。miRNA引导RISC结合至靶mRNA后在胞浆中积聚于P小体(Pbody)内,miRNA可能在P小体中行使其基因沉默功能。经典的理论认为,miRNA利用其5’端2-7个碱基的序列,被称之为“种子”序列(seedsequence)区域识别靶基因mRNA3’-UTR的互补序列,引起靶基因：mRNA的降解或者翻译抑制,从而实现其基因调控功能。miRNA的基因调控功能覆盖细胞内的生长、分化、应激、凋亡、肿瘤发生以及免疫活化等诸多重要的生命过程。除此之外,近年来的研究提示miRNA在病毒与宿主之间相互作用关系中,也发挥着重要的调控作用。一方面病毒可通过利用自身编码的miRNA促进病毒自身复制并抑制宿主细胞抗病毒活性以建立长期隐形感染；另一方面,宿主细胞亦编码大量miRNAs,在调控自身基因表达的同时,亦可调控入侵病毒的复制。此外,宿主miRNA也可能被病毒所利用以促进其维持潜伏或增进复制。最具代表性的便是肝细胞特异性丰富表达的miR-122,其可通过与HCV基因组5’-UTR区的两个互补序列相互作用,增强HCV在肝细胞中的复制,被认为HCV肝脏嗜性的重要因子之一。媒介蚊虫miRNA研究也取得了相当进展。研究者利用高通量测序结合NorthernBlot等实验方法,在疟疾媒介冈比亚按蚊、斯氏按蚊,西尼罗河病毒媒介致倦库蚊以及登革病毒媒介蚊虫埃及伊蚊、白纹伊蚊的研究中,鉴定出了大量miRNAs。其中,本课题组吴锦雅博士、郑培明硕士运用solex测序和NorthernBlot的方法首次鉴定了白纹伊蚊miRNAs。然而,尽管蚊虫的小RNA研究获得了大量miRNA数据,但是基于这些数据的功能分析,特别是有关蚊miRNA与登革病毒相互调节关系的认识却知之甚少。基于此,本研究利用本课题组前期吴锦雅博士和郑培明硕士所获得的白纹伊蚊miRNA序列及雌蚊感染登革病毒前后miRNA表达水平的数据,进一步探讨白纹伊蚊miRNA在调控登革病毒复制方面的潜在功能。目的：本研究基于已获得的白纹伊蚊miRNA测序数据,进一步探讨白纹伊蚊在miRNA水平对登革病毒的调控作用。蚊中肠作为蚊媒病原传播的重要器官,对登革病毒的感染与传播有着非常重要的作用。在本研究中,我们重点关注中肠组织特异性表达的miRNA。首先,构建白纹伊蚊及其C6/36细胞系的登革病毒感染模型。其次,利用人工合成miRNA的模拟物miRNAmimic及miRNA反义抑制剂miRNAantagomiR过表达或者抑制靶miRNA来初步探讨白纹伊蚊中肠组织特异性表达miRNA对于登革病毒复制的调控作用。由于目前临床上针对登革病毒尚无特效的抗病毒药物亦无批准上市的疫苗,因此本研究将为登革病毒的蚊媒防控提供的新思路。方法：1.建立登革Ⅱ型病毒NGC株(DENV-2)感染模型。使用C6/36细胞培养方法繁殖DENV-2,建立白纹伊蚊C6/36细胞系的DENV-2感染模型。使用口饲感染方法,建立白纹伊蚊体内DENV-2感染模型。2.miR-281表达谱分析。使用实时定量PCR(realtimequantitativepolymerasechainreaction,RT-qPCR)结合NorthernBlot方法,首先验证基础高拷贝miR-281在白纹伊蚊头、胸、中肠及剩余组织的表达水平。其次,使用RT-qPCR和NorterhBlot方法还分别检测DENV-2感染1天,4天,7天后miR-281在白纹伊蚊雌蚊、白纹伊蚊中肠组织的表达水平；此外,还使用RT-qPCR方法分别检测DENV-2感染C6/36细胞24h,48h,72h,96h后miR-281的表达水平。3.miR-281细胞水平调控DENV-2复制功能分析。首先使用人工合成miR-281模拟物(miR-281mimic)及相对应的miR-281抑制剂(antagomiR-281)过表达或者抑制C6/36细胞内miR-281表达水平。将miR-281mimic转染C6/36细胞,同时设立无转染处理的对照组mock组、转染controlmimic的对照组controlmimic组；相对应,抑制剂转染组antagomiR-281组设立无转染处理mock组及转染controlantagomiR的阴性对照组controlantagomiR组。转染后48h,使用RT-qPCR检测细胞内miR-281的过表达或者抑制效果。细胞于转染后24h接种DENV-2病毒(MOI=0.1),接种后48h分别提取各组细胞总RNA及总蛋白。总RNA用RT-qPCR方法检测各组DENV-2的基因组RNA(genomicRNA,gRNA)合成水平,总蛋白用WesternBlot方法检测各组DENV-2的Eprotein合成水平。此外,antagomiR-281组及其相应mock,controlantagomiR对照组细胞上清中DENV-2的滴度使用TCIDso法测定。4.miR-281体内水平调控DENV-2复制功能分析。使用胸腔注射方法,将antagomiR-281及对照controlantagomiR分别注射入雌蚊体内,同时设立mock对照组,即未经注射处理的正常白纹伊蚊雌蚊。胸腔注射后48h,各组蚊子经口饲感染DENV-2,感染后第4天,分别提取各组蚊子总RNA并用RT-qPCR检测各组蚊子的DENV-2gRNA合成水平。5.miR-281靶基因预测。首先使用RNAhybrid软件预测niR-281在DENV-2基因组上的潜在靶位点。此外,提取感染DENV-2后48hC6/36细胞总RNA送公司进行转录组测序。使用RNAhybrid与miRanda软件预测miR-281在白纹伊蚊C6/36细胞转录组中的潜在靶基因。6.miR-281靶基因验证。构建EGFP报告基因的载体验证miR-281在DENV-2基因组上的潜在靶位点。以pIB/V5-His表达载体为基础,将EGFP克隆入pIB/V5-His,构建成pIB/EGFP报告载体。以pIB/EGFP报告载体为基础,进一步将预测靶序列克隆入报告载体相应位置构建成为靶标载体,同时突变靶序列中与miR-281种子序列结合位点的碱基,采取与靶标载体一样的克隆策略构建成靶标突变载体。将这两个载体分别与miR-281mimic共转染入C6/36细胞,设立靶标载体与controlmimic共转染的对照,转染后48h使用RT-qPCR分别检测各组细胞中报告基因EGFP的表达水平。为验证miR-281在白纹伊蚊C6/36细胞转录组中的潜在靶基因,细胞分别转染miR-281mimic,controlmimic,同时设未经转染处理的细胞组mock对照组,转染48h后,分别提取各组总RNA,RT-qPCR分别检测各组EGFP表达水平。结果：1.在本实验室成功地建立了白纹伊蚊及白纹伊蚊C6/36细胞DENV-2感染模型,获得了大量高滴度的DENV-2储存液。2.利用qPCR检测方法获得了miR-281的组织表达谱及DENV-2感染后miR-281的表达水平。首先,检测白纹伊蚊雌蚊miR-281在头、胸、中肠及剩余部位的表达水平发现miR-281在中肠组织显著特异性高表达(Welch=276.775,P<0.001)。其次,检测白纹伊蚊雌蚊经口感染DENV-2后第1天miR-281表达水平,发现miR-281在白纹伊蚊雌蚊及其中肠组织中,其表达水平无显著差异(allP>0.05),而在感染后的第4天及第7天,表达水平呈现显著上调(allP<0.001)。此外,在白纹伊蚊C6/36细胞系中,发现细胞感染DENV-296h后表达量显著增高(F=-15.245,P<0.001),而在感染后的24,48和72h则无显著性的变化(allP>0.05)。此外,我们还使用NorthernBlot对表达谱进行了验证,其结果与qPCR检测结果一致。3.使用人工合成miR-281mimic或antagomiR可以显著过表达(F=136.926,P<0.001)或者抑制(F=931.631,P<0.001)C6/36细胞miR-281的表达水平。过表达或者抑制细胞中miR-281后,各组分别感染DENV-2,然后分别从mRNA水平,蛋白水平,以及病毒活力分别检测过表达/抑制组与相应对照组病毒复制水平的差异,发现miR-281表达水平增高,DENV-2gRNA和E蛋白在细胞内的合成水平显著增强(a11P<0.001)；相反,miR-281表达水平下调,DENV-2gRNA与E蛋白的合成水平显著下降(allP<0.001),DENV-2病毒滴度也显著下降(P<0.01)。4.白纹伊蚊雌蚊经胸腔注射antagomiR-281可以显著抑制内源性miR-281在蚊体内的整体水平(F=401.245,P<0.001)及中肠组织中miR-281的表达水平(F=84.625,P<0.001)。抑制雌蚊体内miR-281表达水平后,各组口饲感染DENV-2,感染后第4天检测病毒在体内的gRNA合成水平发现：antagomiR-281注射组即抑制组,其DENV-2gRNA的合成水平显著低于其他对照组(F=103.613,P<0.001)。5.miR-281靶基因生物信息学分析预测。使用RNAhybrid软件,基于自由能(mfe)的分数,预测到miR-281的一个潜在靶结合位点。预测结果显示该靶点位于5’-UTR的一个保守的SLA结构,mfe=-21.4kcal/mol。使用RNAhybrid与miRanda软件同时预测miR-281在白纹伊蚊C6/36细胞转录组中的潜在靶基因。测序结果显示：使用RNAhybrid靶基因预测软件分析预测到35条靶标序列；使用miRanda预测软件分析预测到87条潜在靶基因序列。其中,二者靶序列的交集序列共11条。6.miR-281针对DENV-2靶位点验证实验。以pIB/EGFP报告载体为基础,将DENV-25’-UTR靶序列克隆入报告载体EGFP上游,构建成靶标载体(pIB/5-UTR-EGFP)；突变靶序列中与miR-281种子序列结合位点的碱基并克隆入报告载体EGFP上游,构建成为突变载体(pIB/5UTR-EGFP)。利用EGFP报告基因检测系统研究miR-281和DENV-25’-UTR靶标序列间的相互作用：将这两个载体分别与miR-281mimic共转染入C6/36细胞,设立靶标载体与controlmimic共转染的对照。qPCR结果显示与转染controlmimic相比,miR-281mimic显著增强含5’-UTR靶标序列的靶标载体的荧光强度。然而,对靶标序列进行突变后,miR-281mimic则不能增强含突变靶序列的报告载体的荧光强度(F=40.111,P<0.001),提示miR-281和位于DENV-2NGC株靶标序列间在EGFP报告载体系统中存在相互作用。7.miR-281针对白纹伊蚊C6/36细胞靶基因验证。测序获得了白纹伊蚊C6/36细胞系转录组初步数据,使用靶基因预测软件RNAhybrid与miRanda预测miR-281针对白纹伊蚊C6/36细胞靶基因获得11条交集潜在靶序列。从11条交集序列中进一步选择拥有注释的4条序列进行验证。结果显示：使用RT-qPCR检测过表达miR-281的C6/36细胞中4条序列的表达水平分别与对照组相比(mock和controlmimic),均无显著性差异,提示他们不存在相互作用关系。结论：我们发现白纹伊蚊中肠特异性表达的miR-281在感染DENV-2后呈现表达水平上调。使用人工合成miRNAmimic及其反义抑制物miRNAantagomiR过表达或者抑制细胞及成蚊miR-281表达水平发现,miR-281正向调控DENV-2在细胞水平及其白纹伊蚊体内的复制。为进一步探讨miR-281与DENV-2复制的初步作用机制,使用生物信息学软件预测分析miR-281在DENV-2基因组的潜在结合位点并利用EGFP报告基因载体发现,miR-281与DENV-2基因组5’-UTR序列存在相互作用。现有的结果显示登革病毒可能利用一个白纹伊蚊编码的、病毒感染重要器官中肠组织特异性高表达的miRNA——miR-281增强病毒自身复制水平。其作用方式可能是通过与DENV-2基因组5’-UTR的结合位点结合。据我们所知,这是第一次报道白纹伊蚊组织特异性miRNA对登革病毒复制的调控作用。未来我们还将继续深入探讨miR-281靶向自身的靶基因从而调节登革病毒复制的机制。
【作者】周艳河；
【导师】陈晓光；
【作者基本信息】南方医科大学，病原生物学，2014，博士
【关键词】miRNA；登革病毒；白纹伊蚊；病原-宿主相互关系；

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