HGF刺激的间充质干细胞中β-catenin信号与PI3K/Akt、MAPKs信号的关系

【摘要】间充质干细胞（MSCs）是一种成体干细胞，因其来源广泛、体外增殖快、组织相容性好等优点，广泛运用于临床疾病治疗，例如神经系统疾病、组织损伤等。在干细胞临床移植过程中，发现迁移至受损或病变部位的MSCs数目较少，使得MSCs在损伤修复、疾病治疗中应用十分有限。因此，提高细胞迁移能力，促进迁移到受损或病变部位细胞数目尤为关键。本实验室前期研究发现HGF能够激活MSCs中不依赖于Wnt配体的β-catenin信号通路，阻断β-catenin信号削弱了细胞趋向HGF迁移的能力，说明HGF影响MSCs迁移行为与β-catenin信号相关。同时，阻断迁移相关信号通路PI3K/Akt、MAPKs也在不同程度上影响了MSCs向HGF的迁移。细胞迁移行为的改变最终通过粘着斑形成、骨架的重排而体现。本文旨在通过研究β-catenin信号与迁移相关信号通路PI3K/Akt、MAPKs之间的相互关系阐明MSCs向HGF迁移的分子机制，以及这些信号对MSCs中粘着斑大小、分布及数目的影响。间充质干细胞中β-catenin信号与PI3K/Akt、MAPKs信号之间的关系。Wnt/β-catenin信号通路激活的最终效应是其下游靶基因的表达，而Nedd9、Runx2及Tiam1是Wnt/β-catenin信号通路预测的下游靶基因，并在其它细胞中已证明这三个基因与迁移相关，采用Dkk1或FH535抑制细胞内Wnt/β-catenin信号通路，结果发现三个基因mRNA水平均显著下降，而加入该信号通路经典配体Wnt3a，靶基因转录增强，Dkk1或FH535的加入抵消了Wnt3a促进的这种效应，由此证实了Nedd9、Runx2及Tiam1在MSCs中同样是Wnt/β-catenin的下游靶基因。Runx2是骨骼形态发生所必须的转录因子，可通过与PI3K/Akt信号相互作用，促进成骨及软骨细胞迁移，而已证实Runx2是Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因，影响细胞迁移的PI3K/Akt信号与Wnt/β-catenin信号通路之间又存在着什么关系？据此，本研究阻断Wnt/β-catenin信号检测PI3K/Akt、MAPKs信号关键蛋白分子的表达情况，结果发现Runx2表达减少，细胞中Akt和ERK1/2磷酸化（p-Akt和p-ERK1/2）水平下降，而加入Wnt/β-catenin配体激活此信号并没有进一步提高p-Akt或p-ERK1/2水平，说明MSCs中基底水平Wnt/β-catenin信号是维持Akt和ERK1/2活化所必须的。由于PI3K/Akt与MAPKs信号通路都参与调控细胞的迁移，因此我们分别采用LY294002、PD98059、SB203580、SP600125抑制细胞内PI3K/Akt、ERK1/2、p38MAPK及JNK/SAPK信号，发现抑制PI3K/Akt信号抑制了Wnt/β-catenin信号通路，相反，干扰p38MAPK或JNK/SAPK途径，促进了细胞中Wnt/β-catenin信号的活化，而ERK1/2信号的抑制对Wnt/β-catenin信号没有显著影响。Nedd9和Tiam1的表达也随着经典Wnt信号的改变而变化，它们通过不同方式参与调节整联蛋白介导的粘着斑信号从而影响细胞迁移能力。抑制MSCs中Wnt/β-catenin信号通路，细胞中FAK酪氨酸397位点磷酸化水平显著降低，paxillin酪氨酸118位点磷酸化程度减弱并伴随着总蛋白表达量的下降，激活该信号时这些生物学现象正好相反。阻断PI3K/Akt、MAPKs信号影响Wnt/β-catenin通路的传导，对粘着斑在细胞中的分布、大小及数目也产生了影响。PI3K/Akt信号的干扰导致细胞内粘着斑变大，数目变少，大量的粘着斑定位在细胞周边，呈现一个不利于细胞迁移的状态。阻断p38MAPK或JNK/SAPK通路，FAK酪氨酸397位点的磷酸化及paxillin酪氨酸118位点磷酸化水平上升，细胞发生极化，形成大的片状伪足，粘着斑变小，数目增多，呈现一个利于细胞迁移的状态，p38MAPK通路的干扰同时导致大部分粘着斑定位在细胞周边。ERK1/2信号的阻断，引起了FAK酪氨酸397位点的磷酸化和paxillin酪氨酸118位点磷酸化水平的下降，大量粘着斑聚集在细胞周边，不利于MSCs的迁移。HGF刺激的MSCs中β-catenin信号与PI3K/Akt、MAPKs信号之间的关系。首先，我们检测MSCs接受HGF刺激后细胞中β-catenin信号通路下游靶基因Nedd9、Runx2及Tiam1的转录水平，发现靶基因转录水平升高，加入FH535抵消了HGF带来的这一效应。此结果提示，HGF能够激活β-catenin信号，那影响细胞迁移并同样受HGF激活的PI3K/Akt和MAPKs通路与β-catenin信号之间是否有关联？于是，我们使用PI3K/Akt和MAPKs通路特异性抑制剂，抑制细胞内这些信号，分别从β-catenin蛋白表达、β-catenin胞内定位及β-catenin信号通路下游靶基因转录水平检测对HGF促进的β-catenin信号是否有所改变。我们发现抑制PI3K/Akt及SAPK/JNK信号进一步促进了HGF诱导的β-catenin信号活化，而抑制p38MAPK通路抑制了HGF诱导的β-catenin信号活化，ERK1/2信号通路对这种激活没影响。粘着斑相关蛋白检测发现HGF处理的MSCs内FAK酪氨酸397及paxillin酪氨酸118位点磷酸化水平均显著升高，细胞发生极化，粘着斑变小，数目变多且大部分聚集在周边，阻断经典Wnt信号抵消了HGF诱导的这些效应。干扰PI3K/Akt或SAPK/JNK信号通路并不影响HGF调节的paxillin酪氨酸118位点磷酸化，细胞的极化；阻断ERK1/2通路进一步促进HGF引起的FAK酪氨酸397位点的磷酸化，但并不影响细胞极化及粘着斑分布；干扰p38MAPK信号抑制了HGF促进的细胞极化。综上所述，本实验从β-catenin信号通路与PI3K/Akt、MAPKs信号之间的相互作用关系的角度探索HGF促进MSCs迁移的分子机制，以及信号通路对粘着斑分布、大小、数目的影响，为进一步研究粘着斑周转、细胞迁移提供方向，同时为临床应用MSCs治疗疾病损伤、创伤愈合等提供理论依据。
【作者】谢桂琴；
【导师】张焕相；
【作者基本信息】苏州大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】间充质干细胞；β-catenin信号通路；PI3K/Akt；MAPKs信号；HGF；粘着斑；

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