藏药巴朱中两种化合物诱导肿瘤细胞凋亡及作用机制研究

【摘要】前期研究从喜马拉雅紫茉莉(Mirabilishimalaica)根部乙酸乙酯萃取部位分离得到化合物(E)-3-(4-羟基-2-甲氧基苯基)-苯烯酸-4-羟基-3-甲氧基苯酯(1)和Mirabij-aloneE(2).化合物1对人肝癌细胞HepG2表现出显著的细胞毒活性,其IC50值为15.12μg/mL.化合物2对人肺腺癌细胞A549表现出显著细胞毒活性,其ICs0值为10.97μg/mL.本文将分别开展化合物1对HepG2细胞、化合物2对A549细胞的凋亡诱导及作用机制研究,内容如下：1、利用Brdu免疫荧光及softagar软琼脂实验检测化合物1对HepG2细胞增殖的影响。结果显示,20μg/mL的化合物1作用细胞48h后,与DMSO处理的对照组相比,能下调35.9%的BrdμP日性细胞数。此外,化合物1对克隆形成也有-定影响,与对照组相比,实验组的克隆数目减少约37.0%,克隆形状也明显变小。PI染色对细胞周期的检测显示化合物1阻滞HepG2细胞于S期。与对照组相比,20μg/mL的化合物1能引起S期细胞比例从18.9%上升至36.0%,G1期细胞比例从70.8%下降至52.6%。细胞周期的内源性调控主要是通过Cyclin-CDK-CDI的网络调控来实现。Westernblot分析显示,化合物1能上调cyclinD1、cyclinA、CDK4、CDK6和CDK2的表达,进而影响细胞增殖。本课题前期研究显示化合物1能诱导HepG2细胞凋亡。p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因,50%以上的恶性肿瘤中出现该基因的突变。在HepG2细胞中,p53基因为野生型,是-种抑癌基因。因此,我们检测了化合物1对p53的影响。Westernblot结果显示化合物1能上调p53及其下游基因p21的表达。已有研究报道,p53通过Bax/Bcl-2,Fas/Apol,IGF-BP3等蛋白,可完成对细胞凋亡的调控作用。Bcl-2可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来,具有抗凋亡作用,而Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用,介导细胞色素C的释放,具有促凋亡作用。Westernblot分析发现,化合物1可以上调Bax的表达水平,下调Bcl-2的表达。化合物1作用HepG2细胞后,Caspase-3被激活,产生有活性的两个亚基,其分子量大小分别为17KDa和12KDa,诱导细胞凋亡。此外,通过逆转录病毒介导的转染技术,在HepG2细胞中过表达Bcl-2蛋白后,化合物1不能再次引起显著的细胞凋亡效应,提示化合物1可能激活了内源性通路从而诱导细胞凋亡。进一步研究表明,通过转染特异性的shRNA于HepG2细胞使其干涉p53基因表达后,当化合物1作用p53siHepG2细胞时,与对照组GFPsiHepG2细胞中引起的68.8%凋亡相比,p53的干涉显著降低了化合物1诱导的细胞凋亡,其凋亡细胞数仅有20.6%。以上研究显示,化合物1通过p53依赖方式激活内源性线粒体通路从而引起细胞凋亡。此外,在裸鼠成瘤实验中,通过皮下注射HepG2细胞从而成功接种移植瘤。数据显示,化合物1能够在体内抑制肿瘤的生长,与空白对照组相比,其瘤子体积和重量明显变小。同时,各组裸鼠生长状况良好,给药组裸鼠体重与空白对照组没有显著性差异,提示化合物1在该给药过程中未对裸鼠的正常生长产生不良反应。2、利用Brdu免疫荧光及softagar软琼脂实验检测化合物2对A549细胞增殖的影响。结果显示,20μg/mL的化合物2作用细胞48h后,与DMSO处理的对照组相比,能下调62.2%的Brdu阳性细胞数。此外,化合物2对克隆形成也有一定影响,实验组的克隆数目相比对照组减少约73.9%,克隆形状也明显变小。PI染色对细胞周期的检测显示,对照组及20μg/mL和40μg/mL的化合物2引起的S期细胞比例分别为18.37%,34.13%和48.74%,呈现浓度依赖关系。以上结果表明,化合物2通过阻滞A549细胞于S期,进而影响其细胞增殖。AnnexinV/FITC染色的流式细胞分析表明化合物2诱导了A549细胞凋亡的发生。当化合物2浓度为20μg/mL和40μ/mL时,分别引起了31.7%和48.0%的细胞凋亡,与对照组相比具有显著性差异。Westernblot检测表明,化合物2对Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax有上调作用,同时能下调抑凋亡蛋白Bc1-2。化合物2作用A549细胞后,Caspase-3被激活,产生有活性的两个亚基,诱导细胞凋亡。以上研究显示,化合物2可能通过激活线粒体通路诱导A549细胞凋亡,其深入作用机制有待进一步研究。此外,化合物2在体内裸鼠移植瘤模型中,以浓度依赖方式抑制肿瘤的生长。
【作者】令狐浪；
【导师】陈敏；
【作者基本信息】西南大学，药物分析学，2014，硕士
【关键词】喜马拉雅紫茉莉；HepG2；A549；细胞凋亡；

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