组蛋白H3K9二甲基化参与斑马鱼神经丘发育和毛细胞再生
【摘要】噪声、耳毒性药物和衰老等因素导致人类内耳机械能感受细胞毛细胞的损伤和缺失,是导致获得性感音神经性耳聋的主要原因。和低等的脊椎动物如鱼类、禽类不同,哺乳类动物毛细胞损伤缺失后不能够自发性再生,将导致不可逆的听力损失。因此毛细胞再生调控成为了治疗感音神经性耳聋的终极靶标。但是由于内耳毛细胞深埋于头颅颞骨中,标本获取和处理困难较大,并且不易直接观察,为毛细胞发育和再生调控研究带来了困难。侧线是位于鱼类体表感知水流和压力变化的机械感受器,它是由一组相对独立的神经丘组成,位于神经丘中央的机械感受器毛细胞以及位于周边的非感觉支持细胞构成神经丘的基本结构。侧线毛细胞如内耳毛细胞一样来自始基,具有相似的发育和分化立体模式、相似的的结构以及功能调控机制,由于斑马鱼侧线器位于体表,便于活体观察毛细胞,成为了研究毛细胞再生的经典模型。但在不同的发育时期毛细胞再生可能受到侧线器毛细胞发育及自我修复的影响,因此研究不同发育时期毛细胞再生能力及规律非常重要。机械感受器的发生(如内耳器官发生、神经丘发育)涉及到细胞增殖、细胞凋亡和分化过程,需要严格的时间和空间调控以产生相互作用的特定数目、分布和分化状态的细胞。在此过程中特定基因的有序表达和功能调控具有重要的意义,因此以可遗传的基因表达调控信息传递为主要研究内容的表观遗传学成为了器官发生研究的热点问题。“组蛋白密码”是其重要部分,核小体组蛋白上的共价修饰,在真核细胞的染色质结构重塑和基因表达调控方面起重要作用。组蛋白甲基化作为一个关键调节因素,被认为在基因表达的抑制或者活化、以及染色体结构域中发挥了关键作用。研究表明,在细胞核内,组蛋白甲基化和去甲基化过程处于动态平衡,两过程分别由组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶催化。常染色质组蛋白单-,双-甲基化主要由组蛋白甲基转移酶(HMTase)催化,组蛋白甲基转移酶G9a主要作用于H3K9的单-、双-甲基化。有研究显示G9a调控的H3K9甲基化是细胞分化的必要条件。G9a缺陷小鼠胚胎及其胚胎干细胞中甲基化H3K9急剧下降,其研究结果表明G9a调节常染色体H3K9的甲基化,其为早期胚胎发育所必需且参与发育相关基因的转录抑制。在小鼠视网膜神经节细胞早期分化中,H3K9me2的可以检测到,但出生后消失,提示H3K9me2参与视网膜神经节细胞的发育。H3K9me2在内耳发育及毛细胞再生过程中是否发挥生理作用目前尚不清楚,我们以斑马鱼侧线器为模型,研究H3K9me2与毛细胞发生、发育及再生的关系。第一部分斑马鱼神经丘毛细胞发育实验模型的建立目的建立研究斑马鱼神经丘毛细胞发育的实验模型,定量研究神经丘发育过程中细胞增殖及毛细胞分化过程,为神经丘毛细胞发育机制研究提供实验模型。材料和方法选择野生型AB品系斑马鱼,在3dpf-7dpf的发育过程中以活细胞染料FM1-43FX以及MyosinⅥ标记毛细胞,BrdU标记增殖细胞,观察神经丘的增殖及毛细胞的分化过程。合成地高辛标记fgfrl,atohla的反义RNA探针,进行斑马鱼全标本包埋的RNA原位杂交,研究fgfrl和atohlamRNA在神经丘发育过程中的表达情况。结果1.3dpf-7dpf斑马鱼神经丘毛细胞发育分化的关键时期：以FM1-43FX标记的毛细胞在幼鱼孵育出来前己出现,随着时间推移,毛细胞数目逐渐增加。3dpf为4.100±0.2049(n=6),4dpf为5.386±0.1809(n=14),5dpf为8.467±0.3528(n=6),7dpf为9.225±0.4061(n=8)。Student’st-test统计学分析结果：3dpfvs4dpf,P值=0.0006；4dpfvs5dpf,P值<0.0001,差异具有显著性。5dpfvs7dpf,P值=0.2017,差异无统计学意义。2.3dpf~7dpf斑马鱼神经丘BrdU阳性细胞继续增加：BrdU阳性标记见于神经丘周边区支持细胞细胞核,毛细胞细胞核阳性标记少见。5dpf神经丘BrdU阳性细胞数目2.300±0.3222(n=6),7dpf神经丘BrdU阳性细胞4.333±0.4244(n=6)。统计学分析结果显示P=0.0003,二者差异有显著性。3.fgfrl、atohla在神经丘发育过程中的表达：FGFRmRNA在神经丘的发育过程中表达,证实FGF信号通路参与神经丘的发育；侧线器毛细胞前体细胞在分化为毛细胞时表达atohla,我们的研究显示5dpf斑马鱼神经丘中atohlamRNA表达于神经丘中央区,7dpf时atohla表达降至低水平。由于神经丘毛细胞此后继续再生,atohla阳性毛细胞前体细胞仍将继续存在,进一步证实了atohla参与毛细胞分化及再生的过程。结论1.成功建立了研究斑马鱼神经丘毛细胞发育实验模型；2.建立斑马鱼全标本包埋的RNA原位杂交实验方法；3.定量研究了发育过程中神经丘前体细胞增殖和毛细胞分化,为后期实验提供数据基础。第二部分斑马鱼神经丘毛细胞再生实验研究目的定量研究在不同发育阶段神经丘毛细胞再生能力,观察最佳的研究神经丘毛细胞再生的时间窗,建立斑马鱼神经丘毛细胞再生实验模型。材料和方法选择野生型AB品系斑马鱼,以活细胞染料FM1-43FX以及MyosinVI标记毛细胞,BrdU标记增殖细胞。新霉素处理3dpf,5dpf,7dpf斑马鱼,观察损伤后即刻、24小时、48小时、72小时毛细胞损伤及恢复情况；合成地高辛标记c-mycb,odcl的反义RNA探针,进行斑马鱼全标本包埋的RNA原位杂交,研究c-mycb,odclmRNA在新霉素处理1小时后神经丘中的表达情况。结果1.细胞凋亡是新霉素介导的神经丘毛细胞死亡的主要方式：以FM1-43FX活体染料(红色)标记毛细胞后,予新霉素处理1小时后固定观察——位于神经丘中央区向心性聚集的毛细胞消失,神经丘外周区域可见多个散在的红色质膜包绕的圆形固缩小核——凋亡小体,提示细胞凋亡是新霉素介导的神经丘毛细胞死亡的主要方式。2.不同发育阶段神经丘新霉素损伤后毛细胞再生的规律：3dpf斑马鱼新霉素损伤后24小时毛细胞数目4.250±0.1794(n=12),5dpf斑马鱼新霉素损伤后24小时毛细胞数目2.507±0.1433(n=15),7dpf斑马鱼新霉素损伤后24小时毛细胞数目1.333±0.1491(n=9)；5dpf斑马鱼新霉素损伤后24小时,48小时,72小时毛细胞数目分别为2.507±0.1433(n=15),3.900±0.2878(n=8),9.378±0.3307(n=9),损伤后72小时毛细胞数目达正常对照组87.5%。3.新霉素损伤后神经丘细胞增殖状态：斑马鱼神经丘在新霉素损伤后,BrdU阳性细胞数目增多,但多位于外周支持细胞,新生毛细胞中少见。损伤后72小时FM1-43FX与BrdU共标细胞占毛细胞总数的24.94%±3.75%。4.c-mycb和odc1mRNA在新霉素损伤后神经丘中的表达：新霉素损伤后毛细胞再生机制启动,研究结果显示c-mycb及其下游靶向odc-1在神经丘表达,且二者分布类似。结论1.系统研究了神经丘发育不同阶段毛细胞再生的规律,选择5dpf斑马鱼进行毛细胞再生研究,可剔除毛细胞继续发育的干扰,是研究毛细胞再生的最佳时间窗。2.损伤后毛细胞的恢复多为直接转分化而来,部分新生毛细胞源于细胞增殖再生。3.c-mycb和odclmRNA在新霉素处理后神经丘表达,提示两者参与新霉素介导的毛细胞损伤后的修复过程,以及抗凋亡保护作用。第三部分H3K9me2在正常神经丘发育过程中的作用目的定量研究斑马鱼神经丘发育过程中H3K9me2的表达,探索H3K9me2在神经丘发育过程中的作用。材料和方法1.分别取3dpf,4dpf,5dpf,7dpf野生型斑马鱼作以下3标免疫荧光染色：(1)FM1-43FX标记毛细胞(2)anti-H3K9me2(3)DAPI2.新霉素损伤后恢复72hrs后,作以下3标免疫荧光染色：(1)FM1-43FX标记毛细胞(2)anti-H3K9me2(3)DAPI结果1.神经丘发育成熟过程中H3K9me2表达水平逐渐降低：H3K9me2在3dpf表达于神经丘大部分细胞的细胞核中,4dpf随着神经丘毛细胞分化增多,H3K9me2仅散在表达于神经丘外围细胞；毛细胞分化过程中H3K9me2降低,毛细胞发育成熟后逐渐消失(7dpf)。不同发育阶段的斑马鱼神经丘中H3K9me2(+)细胞与FM1-43FX(+)细胞的比值3dpf:1,830±0.09815(n=4)；4dpf:1.195±0.03175(n=4)；5dpf:1.060±0.1097(n=4)；7dpf:0.6250±0.04907(n=4).统计学分析结果显示：3dpfvs4dpf,P值=0.0008；4dpfvs5dpf,P值=0.2819；5dpfvs7dpf,P值=0.0111。3dpf和4dpf,5dpf和7dpf比值的差异有统计学意义。2.新霉素损伤后神经丘H3K9me2表达增加：新霉素损伤后72小时神经丘毛细胞已基本恢复,花结形成,其外周亦可见较多H3K9me2阳性细胞。H3K9me2(+)细胞与FM1-43FX(+)细胞的比值1153±0.07204(n=4),与7dpf-正常对照组0.6250±0.04907(n=4)相比,P值=0.0009,统计学上有显著性差异。结论1.H3K9me2参与神经丘的发育过程,以及新霉素介导的毛细胞损伤的再生过程；2.毛细胞分化过程中H3K9me2降低,毛细胞发育成熟过程中逐渐消失；3.H3K9me2在增殖期神经丘表达明显,在成熟的毛细胞中表达下调,提示H3K9me2是维持神经丘前体细胞特征的关键分子之一。
【作者】林勤；
【导师】李华伟；
【作者基本信息】复旦大学，耳鼻咽喉科学，2011，博士
【关键词】斑马鱼；侧线发育；毛细胞再生；组蛋白甲基化；表观遗传学；
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