PAI-1通过与玻连蛋白结合减少心脏纤维化和肾脏尿蛋白的机制研究

【摘要】第一部分PAI-1通过与玻连蛋白结合对单肾切／高盐/AmgⅡ小鼠心脏保护作用的研究背景纤溶酶原激活剂抑制剂1(PAI-1)的促纤维化作用主要是由于降低了纤溶酶的活性,从而减少了细胞外基质的降解。然而,近期的研究发现在不同的器官中,PAI-1不仅能促进纤维化,还具有保护作用。PAI-1除了蛋白酶抑制作用外,还能与玻连蛋白(Vn)结合。Vn是一类基质蛋白,可与细胞表面的整联蛋白相结合。本研究的目的是探讨在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心脏纤维化的模型中,蛋白酶抑制途径和Vn途径的作用机制。方法单肾切除的小鼠给予高盐饮食及皮下输注AngⅡ,时间为8周。同时每天腹腔注射不同的人PAI-1蛋白,包括AK(具有蛋白酶抑制作用,但无Vn结合作用),1RR(具有Vn结合作用而无蛋白酶抑制作用)和CPAI(对照PAI-1,具有蛋白酶抑制作用和与Vn结合能力)。对照组使用PBS注射。结果AngⅡ的输注增加了小鼠收缩期的血压和心脏重量。与其余各组相比,AK显著地增加了心肌和间质的纤维化。AngⅡ增加了心脏内源性PAI-1的含量,AK进一步增加了PAI-1的含量。AngⅡ增加了心脏中成纤维细胞的数量,而1RR逆转了成纤维细胞的数量。AngⅡ对心脏中纤溶酶的活性和Vn的蛋白表达没有影响,且在PAI-1干预的各组中也无差异。结论PAI-1通过蛋白酶抑制途径增加细胞外基质聚集而促进纤维化,通过与Vn结合而起到保护心脏,减少纤维化的作用。第二部分玻连蛋白结合的PAI-1通过与成纤维细胞的作用保护心脏减少纤维化背景纤溶蛋白激活剂抑制剂1(PAI-1)在各个器官的纤维化过程中起重要作用。我们体内实验证实在慢性AngⅡ输注／单肾切的心脏纤维化模型中,具有蛋白酶抑制作用的PAI-1加重了心脏纤维化,而具有玻连蛋白(Vn)结合功能的PAI-1减少了心脏内成纤维细胞的数量。本研究的目的是探讨PAI-1是如何通过Vn结合途径和蛋白酶抑制途径对心脏内成纤维细胞作用,从而改变心脏纤维化的程度。方法成纤维细胞来自原代培养的正常成人心室(NHCF-V).以AngⅡ干预48小时。同时给予不同的人PAI-1蛋白,包括AK(具有蛋白酶抑制作用,但无Vn结合作用),1RR(具有Vn结合作用而无蛋白酶抑制作用)和CPAI(对照PAI-1,具有蛋白酶抑制作用和与Vn结合能力)。结果具有蛋白酶抑制作用的AK和CPAI减少了上清液中纤连蛋白的含量,同时降低了纤溶酶原激活剂和纤溶酶的活性。与AK组相比,具有Vn结合能力的1RR和CPAI显著降低了上清液中Vn的蛋白表达,成纤维细胞整联蛋白β3的蛋白表达和成纤维细胞与Vn的粘附能力。1RR和CPAI降低了成纤维细胞的抗凋亡和增生的能力。与AK和CPAI组相比,1RR显著地降低了成纤维细胞的迁移能力。结论体外实验的结果提示具有与Vn结合能力的PAI-1具有保护作用,可减少由AngⅡ诱导的心脏纤维化。PAI-1与Vn结合后,阻止了整联蛋白αvβ3的作用,增加了成纤维细胞的凋亡,抑制了成纤维细胞的增生,粘附和迁移能力,从而起到保护作用。第三部分玻连蛋白结合的PAI-1通过与足细胞的作用减少尿蛋白的机制研究背景在肾脏慢性病变时,小球内纤溶酶原激活剂抑制剂1(PAI-1)表达明显增加,伴有细胞外基质增生及炎症细胞的浸润。然而,近期的研究发现PAI-1在小球病变中有多种作用,尤其是与玻连蛋白(Vn)结合的PAI-1可能直接影响肾固有细胞。本研究通过应用不同的重组突变蛋白,探讨PAI-1对蛋白尿及足细胞的作用机制。方法小鼠模型采用单肾切／高盐／AngⅡ输注,每天腹腔注射不同的人PAI-1突变蛋白或PBS,观察8周。小鼠分为以下5组：1、AK组(具有蛋白酶抑制作用,但无Vn结合作用)；2、1RR组(具有Vn结合作用而无蛋白酶抑制作用)；3、CPAI组(对照PAI-1,具有蛋白酶抑制作用和与Vn结合能力)；4、AngⅡ组(注射PBS)；5、Cont组(仅单肾切／高盐饮食)。体外实验采用原代培养的足细胞,给予PAN损伤,然后加入PAI-1突变蛋白或PBS(分为PAN组、AK组、1RR组和CPAI组4组),观察48小时。结果AngⅡ的输注促进血压升高及蛋白尿增加,1RR与CPAI明显减少蛋白尿,但并不改变系统血压。各组内源性PAI-1表达没有明显改变。AK组人重组PAI-1停滞于毛细血管腔内,而1RR与CPAI组PAI-1沿毛细血管壁沉积,并且明显增加足细胞synaptopodin、减少desmin的表达。体外实验也证实,1RR及CPAI拮抗足细胞的凋亡,保持足细胞骨架蛋白稳定及分化状态,并减少足细胞迁移。结论在单肾切／高盐/AngⅡ诱导的肾脏损伤模型中,PAI-1通过与Vn结合,减轻足细胞的损伤,从而减少尿蛋白的排泄。
【作者】钟建泳；
【导师】顾勇；
【作者基本信息】复旦大学，内科肾脏病学，2012，博士
【关键词】纤溶酶原激活剂抑制剂；心脏纤维化；玻连蛋白；纤溶酶原激活剂抑制剂1；成纤维细胞；整联蛋白；血管紧张素；尿蛋白；足细胞；

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