中药小复方“松友饮”通过下调分化抑制因子1（ID1）抑制肝癌“干性”提高肝癌对化疗敏感性研究

【摘要】研究背景肝细胞性肝癌(以下简称肝癌)在全球的发病率仍呈上升趋势,发病率已居于恶性肿瘤发病率的第5位,死亡率居第三位。手术切除、局部消融对于早期肝癌可获得50-60%的5年生存率。然而,由于肝癌病人或因合并严重的肝硬化,或诊断时已经存在肝内的转移,无法接受手术切除及局部消融等根治性治疗方法。因此超过70%的肝癌需要接受非根治性的治疗方法,如肝动脉栓塞化疗、索拉非尼治疗或系统性化疗。然而,无论是局部的肝动脉栓塞化疗,或者系统性的化疗,治疗肝癌的主要困难是有效率低,即便是治疗有效的患者,多数仍因肝癌的进展或者转移而导致治疗的失败。而治疗失败的主要原因是当前治疗方案虽然可造成肝癌组织细胞的坏死,但难以完全杀灭肝癌干细胞。而且已有的研究,包括我们课题组的前期研究确已证明,化疗可引起残余肝癌细胞生物学特性的恶化,包括上皮细胞间质化改变的发生。因此,进一步研究当前治疗存在的问题,以及通过适当的干预提高现有的治疗方法的效果,无疑对提高肝癌患者治疗效果,改善肝癌患者的预后有重要的意义。方法选用人肝癌细胞株MHCC97H(高转移潜能)和Hep3B(低转移潜能),梯度浓度奥沙利铂序贯培养细胞株,使肝癌细胞株获得耐受奥沙利铂的特性并可稳定生长,获取细胞株并命名为MHCC97H-OXA和Hep3B-OXA,检测该细胞“干性”(stemness)相关特征及标志物变化。对奥沙利铂耐药的细胞株及母代细胞株经裸鼠肝癌原位成瘤,尾静脉注射奥沙利铂,比较观察肿瘤大小、裸鼠体重及肺转移情况。为了研究化疗处理后对肝癌成瘤能力的影响,先裸鼠肝癌皮下成瘤经过化疗后的肝癌组织裸鼠再经肝脏原位接种,比较化疗后肿瘤大小、肺转移、耐药性的改变等“松友饮”过滤除菌,调整浓度至2mg/ml培养肝癌细胞株MHCC97H和Hep3B,4周后获取稳定培养的细胞株并命名为MHCC97H-SYY和Hep3B-SYY,检测细胞“干性“相关特征及EMT、CSC指标变化。“松友饮”联合奥沙利铂治疗裸鼠原位肝癌,观察肿瘤大小、肺转移；全基因组芯片筛选奥沙利铂治疗组和对照组肝癌皮下瘤差异基因,免疫组化和westernblot进行验证,同时在松友饮治疗后的组织和细胞株中进行验证,构建慢病毒干扰／过表达目基因的稳定细胞株,进行功能验证。结果奥沙利铂处理后的肝癌细胞株表现为凋亡数增加、增值速度降低、侵袭能力增强、克隆形成能力增强、CSC比例增加且呈EMT改变；裸鼠原位成瘤,尾静脉注射奥沙利铂5周后裸鼠体重下降(P=0.0296),肺转移结节数增加(P=0.0124)。经奥沙利铂治疗后的肝癌组织再接种原位,同样发现成瘤能力增强(P=0.046),肺转移增加(P=0.0013),耐药性增加和肝内播散增加；“松友饮”培养的肝癌细胞株其中CSC比例下降,呈MET改变,对奥沙利铂敏感性增加,克隆形成能力降低。裸鼠原位成瘤后“松友饮”联合奥沙利铂治疗组较单用奥沙利铂组瘤体明显缩小(P=0.0069),肺转移结节数也明显减少(P=0.014)；全基因组芯片及免疫组化提示奥沙利铂处理过后的肝癌皮下瘤组织中ID1明显增加,而“松友饮”处理过的肝癌组织及细胞株则表达明显降低,进一步构建ID过表达和干扰的细胞稳定株,发现ID1慢病毒干扰稳定株PLVT750侵袭能力减弱(P=0.0116),对奥沙利铂敏感性增加(P=0.0023),成瘤能力也明显降低,而ID1过表达细胞株PSB796侵袭能力增加(P=0.0012),对奥沙利铂敏感性减弱(P=0.0121),成瘤能力明显增强。结论1.奥沙利铂治疗后的肝癌“干性”增强。2.“松友饮”能够降低肝癌的“干性”,同样也可降低奥沙利铂化疗后肝癌增强的“干性”。3.下调分化抑制因子(ID1)是“松友饮”降低肝癌“干性”的关键作用机制之一。应用价值1.明确了化疗后残余肝癌细胞和组织干细胞比例增加、“干性”增强,有助于指导临床对靶向肝癌干细胞药物的探索,从而达到降低肝癌化疗后的转移复发。2.中药小复方“松友饮”能够减少化疗后残余肝癌细胞和组织的干细胞比例,降低其“干性”,弥补当前疗法无法除根(干细胞)的缺陷,为传统中药治疗肝癌提供理论依据。3.中药小复方“松友饮”联合化疗药奥沙利铂可作为临床辅助治疗肝癌的一种方式。创新点1.首次用肝癌干细胞的理论解释了传统中药小复方“松友饮”的作用机理,为中药临床应用提供了理论依据。2.首次报道中药小复方“松友饮”可减少肝癌组织细胞中干细胞的比例、降低其“干性”,增加奥沙利铂治疗肝癌的敏感性。3.首次报道了中药复方“松友饮”可通过下调分化抑制因子ID1,促进肝癌组织及细胞分化,降低肝癌“干性”
【作者】贾庆安；
【导师】汤钊猷；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】肝癌；化疗；中药；肿瘤干细胞；干性；

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