线粒体途径介导热打击诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的研究

【摘要】研究背景和目的：暴露在高温环境下人体可出现一系列不适症状如热痉挛、热晕厥和热衰竭,严重可导致中暑或重症中暑的发生,直接威胁人们的生命。据统计,在2003年夏季欧洲热浪导致了45000人死亡,其中三分之一死亡直接原因为中暑。随着全球变暖,以及热浪袭击频率和强度的增加,其发病和死亡率仍呈继续上升趋势。目前对于中暑病理过程中,导致组织和细胞损伤的机理尚不清楚,因此缺乏特殊有效的临床早期诊断及治疗措施,这也是重症中暑患者高死亡率和致残率的重要原因。在中暑发病过程中,热是最根本的致伤原因。多项动物和细胞实验证实高热可直接诱导组织损伤和细胞死亡,根据遭受热打击的程度不同,细胞可激活凋亡信号或直接坏死。如组织细胞遭受极限温度(49℃～50℃)打击情况下,可在5分钟内直接导致细胞坏死；而一般高热打击大多是激活了细胞凋亡信号,诱导细胞凋亡。因此对于中暑发病过程中组织细胞的损伤形式目前一般认为以凋亡为主。近年来针对热应激分子生物学研究发现,热在广阔的范围内调节着细胞各项生理活动,参与细胞内信号转导过程。包括：调控凋亡相关蛋白caspase的活化,介导细胞凋亡进程；通过热打击过程中产生的各种氧代谢产物、蛋白酶类、细胞因子等作为信号分子抑制或激活多条信号传导通路介导细胞存活或死亡,如活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的大量产生在热打击诱导组织细胞损伤中的作用已逐渐引起人们的关注；通过诱导DNA损伤、p53活化等导致细胞增殖受抑,促进细胞凋亡等。但是这些研究一方面在动物模型上多限于凋亡表象的观察,深入的机制研究还较少,针对于热打击诱导细胞凋亡的精确机制有待进一步阐明。另外一方面在体外细胞实验上多集中于肿瘤细胞株的研究,针对于正常组织细胞的研究较少,鉴于全球升温,以及世界范围内热浪强度和频度的增加,由热引起的疾病发病率和死亡率也在逐年攀升,因此高热引起正常组织细胞损伤的研究迫切需要引起人们的重视。血管内皮细胞作为一个重要器官在热损伤早期损害中占有重要地位,近年来研究发现血管内皮细胞功能、结构受损在中暑脏器损害的发生发展中具有极其重要的作用,是导致重症中暑多器官功能障碍(MODS)的重要原因。动物和细胞实验已证实了高热可诱导血管内皮细胞广泛凋亡。目前尚不清楚内皮细胞凋亡在中暑发病过程中的具体作用,针对于热打击诱导内皮细胞凋亡的机制国内外也尚未见报道。我们前期临床试验发现,重症中暑患者存在严重的血管内皮细胞损伤,主要表现在外周血循环血管内皮细胞(circulationendotheliacells,CEC)数量明显升高,CEC是生理或病理情况下从循环中脱落的血管内皮细胞,是目前唯一能够在活体持续检测到的可特异性、直接反映活体毛细血管损伤程度的指标。进一步体外细胞实验发现,热打击对内皮细胞具有直接细胞毒效应,导致细胞增殖受抑。但是对于内皮细胞遭受热打击后细胞的表现形式、细胞损伤机制等仍有待进一步阐明。基于前期研究结果,本研究目的在于探讨热打击诱导内皮细胞凋亡的具体机制,阐明介导热打击诱导细胞凋亡的信号通路、上游信号分子以及中间环节各信号分子之间的相互作用,从分子水平上了解热打击诱导内皮细胞凋亡机制,为揭示中暑内皮细胞介导的病理过程奠定基础,也为临床中暑预防和治疗提供理论依据。主要方法和结果：1.热打击对人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)细胞具有直接细胞毒效应,诱导了细胞早期凋亡收集热打击(43℃,2h)后不同复温时间点(0、1、3、6、9h)及37℃对照组细胞,使用乳酸脱氢酶(LDH)法和水溶性四唑盐(WST-1)法检测热打击对细胞的损伤,评价热的细胞毒效应。AnnexinV/PI染色,并用流式细胞仪观察热打击后细胞凋亡。热打击对细胞的损伤作用在早期即出现：复温0小时开始细胞损伤随复温时间的延长而加重(F:109.459,P：0.001)。细胞凋亡由对照组4.4%在复温后3小时左右明显增加到12%,而复温6小时细胞凋亡近30%(F：959.117,P：0.001)。2.热打击激活了内质网应激的UPR反应但没有启动内质网应激凋亡途径,而是启动了线粒体凋亡途径提取热打击后不同复温时间点(0、1、3、6、9h)和37℃对照组的HUVEC细胞总蛋白,Westernblot方法分析UPR反应相关蛋白p-PERK、P-eIF2a、ATF4、XBP-1s、内质网分子伴侣GRP78以及ER凋亡相关蛋白GADD153的表达。RT-PCR方法检测热打击后不同时间点EDEM基因的转录。结果发习PERK在热打击复温Oh左右即被自我磷酸化而激活,随后其激活被逐渐抑制。eIF2a的磷酸化激活发生在热打击复温1h左右,稍晚于PERK的激活,其活化在1h左右即达到高峰,随着复温时间的延长开始逐渐下降。ATF4在3h左右表达增强,6h表达进一步增强,9h表达明显被抑制。ATF6在热打击后复温0h左右表达最强随后降低,在3h左右回复到基线水平。XBP-1s的表达在1h左右增加,在3h达高峰,随后也逐渐降低,EDEM基因的转录检测显示与XBP-1s蛋白的激活诱导相一致；GRP78在热打击0h被激活,持续到热打击后3h左右,其后激活状态逐渐被抑制；而热打击没有明显促进GADD153的表达。以上结果说明了热打击在作用的早期明显诱导了UPR三条信号通路的激活,即ERK-eIF2a-ATF4,IRE1-XBP-1S和ATF6,而随着复温时间的延长,UPR的激活逐渐被抑制,但热打击没有激活ER应激凋亡途径。利用caspase活性检测试剂盒分别检测热打击细胞caspase-9、-8、-4、-3的活化。荧光分光光度计检测经JC-1标记的热打击细胞。并分别提取线粒体和细胞质蛋白,Westernblot方法分析热打击细胞的细胞色素c的亚细胞表达。发现热打击后细胞caspase-9、-3在3h左右活化,6h达到最高值,9h后稍有降低(caspase-9F:47.903,P：0.001;caspase-3F：65.602,P：0.001);没有检测到热打击后caspase-4、-8的活化(caspase-4F：2.146,P:0.149;caspase-8F:0.604,P：0.669);热打击后3、6、9h也检测到了线粒体膜电位呈复温时间依赖性明显下降,细胞色素c的释放与线粒体膜电位下降趋势一致。以上结果表明热打击主要启动了线粒体凋亡途径。3.热打击诱导了p53转录非依赖介导的线粒体凋亡通路使用p53-siRNA降低细胞p53蛋白的表达,热打击p53-siRNA转染的细胞。结果显示p53-siRNA明显降低了热打击诱导的细胞凋亡,同时也部分抑制了热打击诱导的细胞色素c的释放、线粒体膜电位的下降以及aspase-9的活化。分别提取线粒体和细胞质蛋白,Westernblot方法分析热打击后p53蛋白的亚细胞表达,激光共聚焦观察p53蛋白亚细胞定位。结果发现热打击诱导了p53蛋白转位到线粒体。进一步使用PFT预处理细胞,结果显示PFT明显抑制了热打击诱导的p53蛋白线粒体转位,同时也抑制了细胞色素c的释放、线粒体膜电位的下降以及caspase-9的活化(caspase-9F:11.810,P：0.001;⊿ΨmF:13.202,P:0.0001)。这一结果说明了热打击引起p53转位到线粒体,进而启动了线粒体凋亡通路。4.热打击诱导了细胞内Ca2+失稳激活MPTP开放介导的线粒体凋亡通路使用Ca2+敏感的荧光染料Flou-3AM标记胞质Ca2+,流式细胞仪分析热打击复温各时间点的细胞内Ca2+水平。同时用Flou-3AM绿色荧光标记细胞内Ca2+,Mitotracker红色荧光标记线粒体,激光共聚焦显微镜观察热打击后细胞内Ca2+的分布。结果显示热打击在0h导致胞质Ca2+水平升高,1h达到高峰,其后逐渐降低。激光共聚焦分别观察对照组、热打击后复温1h、热打击后复温6h的荧光分布,发现热打击后复温1h标记Ca2+绿色荧光和标记线粒体的红色荧光部分重叠呈橙色,复温6h大部分绿色荧光和红色荧光重叠为橙色,表明热打击后胞质内Ca2+大部分被线粒体吸收,可能导致线粒体钙超载。我们进一步分析了Ca2+下游的两个标靶线粒体通透性转换孔(MPTP)和钙蛋白酶(calpain)的活化。使用酯化钙黄绿素(Calcein-AM)和氯化钴(CoC12)共孵育的方法检测MPTP开放。Calpain活性检测试剂盒分析Calpain的活化。热打击后1h左右观察到明显的MPTP开放,表现为线粒体荧光强度随着复温时间的延长而逐渐减弱(F：40.293,P：0.001),而Calpain没有被热打击活化。并且,Ca2+螯合齐BAPTA-AM完全阻滞了热打击复温1h的MPTP开放。利用特异性MPTP抑制剂环孢素A(cyclosporinA,CsA)预处理细胞,发现CsA部分抑制了热打击诱导的细胞色素c的释放、线粒体膜电位下降以及caspase-9的活化,与未使用CsA处理组相比差异明显(caspase-9F:4.958,P：0.008;⊿ΨmF:3.668,P：0.021)。表明了MTTP开放参与了热打击诱导线粒体凋亡通路的激活。5.Bax构象改变和线粒体转位介导了热打击诱导的线粒体凋亡通路收集热打击后不同复温时间点及对照组细胞,提取线粒体和细胞质蛋白,Westrenblot分析Bax蛋白的亚细胞表达,同时用pEGFP-C3-Bax质粒转染HUVEC细胞(GFP-Bax细胞),激光共聚焦显微镜观察热打击凋亡细胞GFP-Bax蛋白亚细胞分布。结果发现热打击复温3h左右细胞质中的Bax蛋白表达随着复温时间而逐渐减少,而线粒体中Bax蛋白表达相应的逐渐增多,热打击后GFP-Bax蛋白的绿色荧光与Mitotracker标记的红色荧光大部分重叠呈橙色。进一步收集热打击后复温0、1、3、6、9h和对照组的HUVEC细胞,然后用抗Bax6A7抗体把己发生构象变化的Bax蛋白免疫沉淀下来用以Westernblot分析,结果显示对照组和热打击后0、1h组未检测到发生构象变化的Bax,而在3、6、9h可以检测到发生构象变化的Bax。利用Bax-siRNA方法降低细胞Bax的蛋白水平表达,发现Bax-siRNA显著抑制了细胞色素c的释放、线粒体膜电位下降以及caspase-9的活(caspase-9F:11.810,P:0.008;⊿ΨmF:7.878,P:0.021)。6.热打击引起P53线粒体转位和MPTP开放共同介导了Bax构象改变和线粒体转位热打击PFT和CsA预处理的HUVEC细胞,在热打击后复温6h收集细胞,分别提取线粒体蛋白和细胞质蛋白,Westrenblot分析Bax蛋白的亚细胞表达。进一步用抗Bax6A7抗体免疫沉淀发生构象改变的Bax蛋白,Westrenblot分析构象改变Bax蛋白的表达水平。结果显示PFT和CsA均有效抑制了热打击诱导的Bax构陷改变和线粒体转位。说明p53线粒体转位和MPTP开放共同介导了热打击诱导的Bax构象改变和线粒体移位。7.热打击引起ROS产生介导了P53线粒体转位和Ca2+失稳,以及下游线粒体凋亡通路的活化收集热打击后不同复温时间点(0、0.5、1、3、6、9h)和37℃对照组的HUVEC细胞,分别使用了荧光探针DHE、DHR和DAF-FMDA标记细胞,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测热打击后02-、H202和NO在细胞内的表达。热打击主要诱导了02-和H202这两种自由基的升高(O2-F:225.788,P:0.008;H2O2F：256.770,P：0.021),而对NO没有明显的影响(F:2.000,P：0.134).02-和H202的升高趋势不完全一致,热打击后Oh02-即显著升高,而H202在0h改变不明显,在0.5h开始明显升高,02-和H202的升高趋势均呈复温时间依赖性。MnTBAP、PFT以及BAPTA-AM预处理细胞,43℃热打击细胞2h,继续在37℃细胞培养箱中孵育0h或6h,收集细胞。结果显示MnTBAP完全抑制了热打击复温Ohp53的线粒体转位和细胞内Ca2+水平升高,同时MnTBAP也显著抑制了热打击诱导的细胞凋亡、Bax蛋白构象改变和线粒体转位以及下游的细胞色素c释放、线粒体膜电位降低和caspase-9的活化(caspase-9F:6.386,P:0.003;⊿ΨmF:6.827,P:0.002)。而PFT以及BAPTA-AM对热打击复温0h的ROS没有影响。结论：1.热打击激活了ER激UPR反应的三条信号通路：PERK-eIF2a-ATF4、IRE1-XBP-1S、ATF6,但是没有激活ER应激凋亡途径,而是通过激活线粒体凋亡途径介导细胞凋亡。2.p53在热打击诱导细胞凋亡中起着重要的作用,并以转录非依赖的方式参与介导了线粒体凋亡途径。3.细胞内Ca2+水平失稳也在热打击诱导细胞凋亡中发挥了重要的作用,热打击首先迅速诱导胞质钙离子升高,继而线粒体超载,在这一过程中激活了MPTP开放,从而启动线粒体凋亡途径。4.Bax蛋白是热打击诱导细胞凋亡过程中的中间环节,p53转录非依赖方式和Ca2+失稳激活的MPTP开放通过诱导Bax蛋白构象改变和线粒体转位启动线粒体凋亡途径。5.热打击诱导细胞产生的ROS是启动细胞凋亡途径的上游信号分子,分别激活了p53线粒体转位和细胞内Ca2+水平失稳,从而介导下游线粒体凋亡通路。
【作者】古正涛；
【导师】苏磊；
【作者基本信息】南方医科大学，急诊医学（专业学位），2014，博士
【关键词】热打击；凋亡；线粒体；活性氧；p53；Ca2+失稳；

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