稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因克隆及五氯酚对其DNA甲基化影响
【摘要】铜蓝蛋白(Ceruloplasmin,EC1.16.3,缩写为Cp)是一种重要的铜转运蛋白,参与生物体内铜的转运、铁的代谢、氧化自由基的清除、新生毛细血管的形成、神经及胚胎发育等过程。铜蓝蛋白在生物体发育的不同阶段,为各种组织器官提供高效、稳定、易于利用的铜源，满足,生命活动所需。同时,在医学上是各种炎症、感染、中毒及癌症疾病的标志性蛋白。铜蓝蛋白自发现以来备受研究人员的关注,在人和小鼠中该蛋白的研究已取得丰硕成果,但在鱼类中报道较少,尤其在稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)中还是空白。此外,随着环境污染不断加重,人们开始重视环境检测、污染治理及污染对人类影响等方面的研究。水污染作为环境污染重要组成部分,与人类日常生活密切相关,成为治理与监测中的重点。据调查研究结果发现,我国各大水系中五氯酚的检出率和平均浓度相对较高,成为水环境中较大的污染源,已被列为优先监测及严格控制的持久性环境污染物,对其的监测和影响研究成为众多研究领域中的重要目标。而近年来,表观遗传学作为分子毒理学研究的最新热点,成为了低剂量环境污染对生物体损害影响研究中的重要组成部分。因此,本论文的研究内容主要分为两个部分：第一部分,通过RACE和基因组步移技术,对稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因全长cDNA和启动子序列进行克隆及序列生物信息学分析、蛋白高级结构预测、系统发育树构建和组织表达分布研究；第二部分,根据我国水系中五氯酚的实际污染情况,在实验室中复制了五氯酚对鱼类影响的亚慢性毒性试验,通过分析稀有鮈鲫肝脏铜蓝蛋白基因的DNA甲基化差异,来研究稀有鮈鲫体内该基因在五氯酚暴露下的调节反应。本论文的主要研究结论如下1.基于序列同源性,采用RACE技术,以稀有婀鲫肝脏cDNA为模板,通过PCR扩增得到长度为3389bp的铜蓝蛋白基因全长cDNA序列,其中包含22bp的5’UTR序列和103bp的3’UTR序列,3264bp的开放式阅读框,预测编码1087个氨基酸。同源性分析结果显示,稀有鮈鲫铜蓝蛋白与斑马鱼铜蓝蛋白的核苷酸、氨基酸序列同源性最高,分别为88.1%和90.3%。2.基于获得的cDNA5’UTR序列,采用基因组步移技术,得到启动子序列共1430bp,核心区域730bp,GC含量为40.55%,有1个满评分的转录起始位点,同时存在GATA-1,2,3和CdxA等数个转录因子结合位点。3.稀有鮈鲫铜蓝蛋白相对分子质量为124429.1D,等电点为6.41,含有A1、A2和B等9个结构域。高级结构预测结果显示,稀有鮈鲫铜蓝蛋白二级结构主要由α-螺旋、p-转角、延伸链和无规卷曲组成。分别占29.53%、7.64%、23.09%和39.74%。三级结构3D模型图显示,稀有鮈鲫铜蓝蛋白与斑马鱼、人铜蓝蛋白三级结构相似,属同一蛋白模型。4.运用MEGA5软件比对氨基酸序列并构建系统发育树。13个物种分为4组：哺乳类、鸟类和爬行类属于一组,两栖类独自为一组,稀有鮈鲫、斑马鱼和斑点叉尾鮰聚为一支,其他4种鱼类构成一组,其中稀有鮈鲫与斑马鱼亲缘关系最近。5.采用荧光定量PCR法,以β-actin为内参基因,分析铜蓝蛋白在稀有鮈鲫不同组织中的相对表达量。结果显示该基因广泛分布于各组织中,其中肝脏的相对表达量最高且显著高于其他组织(P<0.01),其他组织表达量较低且组织问差异均不显著(P>0.05)。6.五氯酚暴露处理60天后,提取稀有鮈鲫肝脏DNA,进行铜蓝蛋白基因DNA甲基化水平分析。结果发现,3个组别中该基因DNA甲基化程度分别为63.16%(对照组)、67.54%(0.6μg/L组)和73.68%(6μg/L组)。相比于对照组,2个处理组中DNA甲基化程度分别提高了4.38%和10.52%,均呈显著性差异。2个处理组之间相比,DNA甲基化程度提高了6.14%,同样具有显著性差异。结果说明：五氯酚能够引起稀有鮈鲫肝脏细胞铜蓝蛋白基因DNA甲基化水平上调,并且上升水平与五氯酚浓度成正相关。
【作者】景致；
【导师】张耀光；彭作刚；
【作者基本信息】西南大学，动物学，2014，硕士
【关键词】铜蓝蛋白；稀有鮈鲫；序列分析；基因克隆；基因表达；五氯酚；表观遗传学；甲基化影晌；
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