孕激素（DHP）在硬骨鱼类减数分裂启动过程中的作用机制研究

【摘要】性腺由生殖细胞和体细胞共同构成,因此性别决定与分化包括体细胞的性别决定与分化和生殖细胞的性别决定与分化,而生殖细胞的性别决定与分化过程指的就是生殖细胞减数分裂启动过程。对于整个脊椎动物来说,双向潜能性腺中的生殖细胞在雌性个体进入减数分裂的时间往往早于雄性个体。普遍的观点认为,性腺中视磺酸(RA)分解酶(Cyp26bl)的表达决定RA的水平,进而控制雌雄差异的减数分裂启动过程。但这种观点并没有在非哺乳脊椎动物得到证实,甚至有报道持完全相反的观点,认为并非RA,而中肾合成的未知化合物才是调控减数分裂启动的关键因子。因此,脊椎动物生殖细胞减数分裂启动的分子机制尚需大量的深入研究。鱼类孕激素(DHP)能够诱导卵子(精子)最终成熟以及排卵(精)过程。配子成熟过程是第二次减数分裂,因而我们认为DHP可能在第一次减数分裂,即减数分裂启动过程中可能发挥重要作用。于是我们以罗非鱼为实验材料,通过DHP核受体基因pgr的克隆和Pgr拮抗剂处理实验,深入研究DHP在硬骨鱼类生殖细胞减数分裂启动过程中的作用及其可能的分子机制。主要研究结果如下：1)首次从罗非鱼性腺成功克隆了孕激素(DHP)的核受体pgr基因。氨基酸序列比对结果显示,罗非鱼pgr基因编码了核受体家族成员共同的保守结构域：N端转录激活结构域,DNA结合结构域(DNA-bindingdomain,DBD)和配体结合结构域(Ligand-bindingdomain)。系统进化分析结果表明,罗非鱼Pgr与其他硬骨鱼类的Pgr聚为一簇,而其他四足动物的Pgr单独聚为一簇,证明我们从罗非鱼性腺分离和克隆到的pgr基因是真正的DHP核受体基因。2)用Real-timePCR和免疫组织化学的方法检测了pgr组织分布和个体发生过程的时空表达模式。组织分布研究发现,罗非鱼pgr在性腺中的表达水平要明显高于其它组织。在个体发生过程中,pgr的表达水平在生殖细胞减数分裂启动的关键时期出现显著的上升,其后一直保持高水平表达直到成体。免疫组化研究结果表明,在罗非鱼性腺发育的不同时期pgr表达的细胞类型不同。在孵化后30天的XX性腺,Pgr表达于间质细胞细胞,而在成体性腺,主要表达于滤泡细胞层。在孵化后两个月的XY性腺,Pgr表达于支持细胞,而在成体性腺,主要表达于成熟的精子细胞。这些表达模式表明,Pgr可能通过调控DHP通路,而在生殖细胞减数分裂启动过程中发挥重要作用。3)用Pgr的拮抗剂RU486从孵化后5天开始处理基因型为XY的单性鱼苗,随后在不同时间点取样观察检测。与正常雄鱼相比,持续四个月的RU486处理导致XY个体性腺的生殖细胞不能进入精子发生过程,整个性腺未观察到减数分裂的生殖细胞,。生殖细胞相关基因表达量显著降低,而雄性体细胞相关基因表达未受到影响,说明RU486处理仅仅影响了雄性生殖细胞的的增殖和精子发生,但没有影响性腺体细胞雄性化状态。而在RU486处理两个月和两个月的继续正常饲养的XY个体,生殖细胞能进行正常的减数分裂过程,可看到各级生殖细胞,包括精原细胞,精母细胞以及精子细胞等。RU486处理四个月然后正常饲养五个月的性腺可观察到大量的精子细胞,说明RU486处理停止后,罗非鱼体内合成的DHP回救了生殖细胞减数分裂阻滞现象。在RU486处理的同时,我们尝试通过过量DHP和11-KT进行回救,结果发现,DHP能够回救RU486的影响,诱导正常精原细胞增殖和精子发生过程,而11-KT不能回救RU486对精子发生过程的影响。Real-timePCR检测结果表明,RU486持续处理导致生殖细胞相关基因表达量显著降低,而Sertoli细胞标志基因如：Amh、Dmrt1、Gsdf,以及催化11-KT(鱼类雄激素)合成的类固醇合成酶的表达都未受影响。而RU486处理却导致DHP合成关键类固醇合成酶Cyp17a2表达量显著降低,说明RU486处理可能抑制DHP合成。酶联免疫实验(EIA)表明,RU486处理并没有影响血清中11-KT的合成水平。综上所述,RU486通过竞争性地结合Pgr而阻遏DHP通路,进而抑制精原细胞增殖和精子发生过程。因此,DHP通过其核受体Pgr激活下游信号通路分子,在罗非鱼精原细胞的增殖和减数分裂过程中发挥着举足轻重的作用。同时,RU486处理并没有影响11-KT合成而抑制了精子发生过程,因此DHP调控减数分裂的启动过程跟11-KT完全不同。4)用Pgr的拮抗剂RU486从孵化后5天开始处理基因型为XX的单性鱼苗,随后在不同时间点取样观察检测。持续四个月的RU486处理,同样导致生殖细胞不能进行增殖以及后期的减数分裂过程,并且导致XX性腺体细胞发生雄性化,颗粒细胞前体细胞发育为Sertoli细胞,并能够检测到Dmrt1,Gsdf等基因的表达；间质细胞前体细胞分化为Leydig细胞,能够检测到催化雄激素11-KT合成的类固醇合成相关基因(Star和Cyp11b2)的表达。持续三个月的RU486处理和一个月的继续饲养(正常饲料),导致XX个体性腺完全性逆转为精巢,并发现性逆转的精巢存在不同发育阶段的生殖细胞如精原细胞,精母细胞和精子细胞。该实验表明DHP对于XX个体生殖细胞正常的增殖及减数分裂启动过程也是至关重要的。在XX个体,生殖细胞减数分裂对于卵巢的分化和维持是必需的。总之,DHP作用的阻断能够阻滞硬骨鱼类生殖的有丝分裂和细胞减数分裂的启动过程,进而影响其正常的性别决定和分化过程,因此,我们初步证明DHP通过核受体Pgr激活的下游信号通路在硬骨鱼类减数分裂的启动过程中发挥重要作用。
【作者】刘刚；
【导师】周林燕；
【作者基本信息】西南大学，动物学，2014，硕士
【关键词】性别决定和分化；Pgr；RU486；雄性化；性逆转；减数分裂启动；精子发生；

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