小反刍兽疫及口蹄疫病毒抗原基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究

【摘要】口蹄疫（footandmouthdisease，FMD）、小反刍兽疫（pestedespetitsruminants，PPR）和羊痘（capripox，CP）是危害山羊、绵羊等小型反刍动物的3种重大疫病，均为世界动物卫生组织（OIE）发布的A类烈性传染病。3种疫病的病原分别是口蹄疫病毒（footandmouthdiseasevirus，FMDV）、小反刍兽疫病毒（pestedespetitsruminantsvirus，PPRV）和羊痘病毒（capripoxvirus，CPV）。目前这3类疫病的防控主要依靠灭活苗或弱毒苗，在实际应用中存在着免疫持续期短、热稳定性差、病毒毒力有返强风险等诸多缺陷。因此，需要研制更为安全高效的新型疫苗。病毒载体是现代生物科学研究的热点之一，诸多病毒载体已成功构建，并成为研制新型疫苗的候选工具。羊痘病毒活载体就是其中之一。在上述3种感染羊的病毒中，PPRV的H蛋白和F蛋白是刺激机体产生中和抗体的主要抗原；而FMDV的P1-2A在3C的作用下可以形成病毒的核衣壳，是中和抗体产生的主要诱导物，其中P1蛋白中的VP1片段是抗原决定簇最集中的区域，因此，PPRV的H和F基因、FMDV的VP1基因和P12A3C片段是研制亚单位疫苗和重组疫苗的主要候选基因。本研究利用DNA重组技术，构建用于羊痘病毒重组的基因工程转移载体，通过转移载体和病毒之间的同源重组，将PPRV和FMDV的抗原基因分别插入到羊痘病毒基因组中，形成重组羊痘病毒，作为转运外源蛋白的活载体，旨在研制一种能有效预防PPR、羊FMD、羊痘的高效疫苗。获得结果如下：1.构建了重组转移质粒ptkpp，并通过延长重组同源臂、插入报告基因GFP和压力筛选基因gpt、引入多克隆位点，优化了其功能，最后形成了可重复使用的转移质粒pftkpgigp和pftkpgigpi；验证了重组转移质粒启动子p7.5和p11的功能，为此系列质粒的正常使用奠定了基础。2.将PPRV和O型FMDV的抗原基因分别插入转移质粒pftkpgigp和pftkpgigpi的多克隆位点中，构建了6个重组质粒：pftkpgigp-H、pftkpgigp-F、pftkpgigp-VP1、pftkpgigp-P12A3C、pftkpgigp-H-i-P12A3C、pftkpgigp-F-i-P12A3C，以用于和羊痘病毒的同源重组。3.用脂质体转染法将6个重组转移质粒分别导入预先感染羊痘病毒的羔羊睾丸细胞中，经同源重组获得了6株重组羊痘病毒第一代混悬液。然后用选择培养液反复培养筛选纯化，通过GFP的表达、细胞病变效应以及PCR法检测，初步鉴定形成了4株重组GPV，分别命名为rGPV/FMDV-VP1（携带FMDVVP1基因）、rGPV/PPRV-F（携带PPRVF基因）、rGPV/PPRV-H（携带PPRVH基因）、rGPV/PPRVF-FMDVP12A3C（携带PPRVF基因和FMDV的P12A3C片段）。4.4株rGPV分别感染LT细胞，经RT-PCR检测mRNA的转录状况，后用间接免疫荧光技术检测外源基因的表达。结果显示，所有插入的外源基因得到了正常转录，其表达产物与特异性抗体之间产生了良好的免疫反应。5.4株rGPV按105TCID50剂量经皮内接种山羊，分别诱导产生了较高水平的抗GPV、FMDV和PPRV抗体；产生的抗GPV抗体效价和GPV疫苗差异不显著，抗FMDV抗体效价和疫苗组差异显著，抗PPRV效价在加强免疫后和疫苗组差异不显著。
【作者】李继东；
【导师】才学鹏；
【作者基本信息】中国农业科学院，预防兽医学，2014，博士
【关键词】羊痘；小反刍兽疫；口蹄疫；病毒载体；同源重组；疫苗；

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