饭豆根尖早期铝应答基因的鉴定与功能分析

【摘要】饭豆(Vignaumbellata)是一种在酸性土壤中生长表现良好的豆类作物。前期研究表明,铝(Al)诱导饭豆根尖柠檬酸的分泌有数小时的滞后期,暗示蛋白的重新合成是分泌所必需的,但这一过程中所涉及的调控基因仍不得而知；介导Al诱导饭豆柠檬酸分泌的转运子基因VuMATE1在无A1条件不被转录,而在Al胁迫下被大量诱导表达,因此鉴定饭豆早期Al响应基因可以为饭豆根尖柠檬酸分泌调控提供有价值的信息；高浓度Al在显著抑制根伸长的同时往往会引发细胞次级胁迫的产生,这不利于辨别真正的Al胁迫靶标。在本研究中,为鉴定调控饭豆柠檬酸分泌的新组分,揭示饭豆Al耐性和毒性相关的分子机制。我们构建了低浓度和高浓度Al胁迫早期的抑制差减文库(Suppressionsubtractivehybridization,SSH),从中鉴定了一批Al上调和下调的差异表达基因,并对其进行了分析。同时,对其中一个潜在的可能参与柠檬酸分泌调控的转录因子基因VuSTOPl进行了研究。主要研究结果如下：(1)成功构建了饭豆5和25μMAlCl3处理4h的正反向差减文库。结合反向Nothern杂交和定量PCR鉴定到815个差异表达的EST序列,这些序列代表了394个Unigenes。根据GeneOntology分类显示,这些Unigenes可以被归类为“信号转导与转录”,“转运”,“胁迫/防御应答”,“代谢与能量”,“细胞壁合成与结构”,“细胞分化与细胞骨架”,“蛋白质翻译进程与降解”,“DNA与RNA代谢”,“未知功能”以及“无匹配”10个功能大类。在已知功能基因中,与“代谢与能量”,“信号转导与转录”以及“转运”相关的基因被优势上调表达,而与“蛋白翻译进程与降解”相关的基因被优势下调表达。对两个处理浓度下差异基因的表达谱分析发现,调控柠檬酸分泌基因的上调在饭豆应答低浓度和高浓度Al胁迫的耐性机制中扮演了重要的作用；代谢(能量)和蛋白合成的改变是饭豆应答Al胁迫时的自发适应性机制并可能与Al的耐性相关；高浓度Al对饭豆根伸长的抑制可能与水分和矿质营养元素运输以及细胞分化相关基因的下调有关。(2)根据文库中鉴定到的EST序列信息,通过Rapid-amplificationofcDNAends(RACE)PCR技术从饭豆中扩增了一个STOP1类直系同源基因,命名为VuSTOP1。序列分析显示,该基因cDNA全长1772bp,能够剪切形成两个转录本,其中VuSTOP1.1长1497bp,编码498个氨基酸,VuSTOP1.2长1263bp,编码420个氨基酸。氨基酸同源性比对及进化树分析表明,VuSTOP1与其它已知物种中的STOP1类蛋白一样,拥有4个高度保守的Cys2His2锌指蛋白结构域,在进化关系上,与菜豆亲缘关系最近,其次是大豆。Southern杂交显示,VuSTOP1是一个单拷贝基因。对两个转录本的定量PCR分析表明,VuSTOP1.1与VuSTOP1.2表达模式基本一致,主要在饭豆根中表达,其中基本根(1-2cm)中的表达量高于根尖(0-1cm),而在叶中的表达量最低,Al和蛋白合成抑制剂亚胺环已酮(Cycloheximide)能显著诱导其表达量的增加,低pH和重金属镉(Cd)可轻微上调其表达。进一步对VuSTOP1基本特性进行分析显示,VuSTOP1定位于细胞核中,具有两个转录激活域,分别位于N端1-78氨基酸残基和C端389-498氨基酸残基区间。利用拟南芥AtSTOP1启动子接VuSTOP1回复到拟南芥同源stop1突变体中发现,VuSTOP1可以通过回复AtSTOPl调控的H+耐性基因较大程度地回复stop1的H+敏感性表型,同时也可通过部分回复AtMATE1和ALS3的表达,少许地回复stop1对Al的敏感性表型。
【作者】范伟；
【导师】郑绍建；杨建立；
【作者基本信息】浙江大学，植物学，2014，博士
【关键词】饭豆；铝胁迫；抑制差减杂交；代谢；柠檬酸分泌；转录因子；

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