魔芋多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

【摘要】魔芋乃天南星科魔芋属多年生草本植物,在我国西南山区具有悠久的栽培历史。其地下球茎富含葡甘聚糖,因其特殊的理化性质,对高血压、糖尿病、肥胖、便秘等有预防与辅助治疗作用,同时在化工、环保、建筑等领域也有广泛的应用前景。魔芋球茎含水量高,在种芋运输过程中极易碰伤而产生褐变,影响种芋质量,从而影响产量。球茎在加工成魔芋粉的过程中,去皮和切片使细胞组成物质在酶的作用下发生褐变,影响魔芋粉的品质。因此,控制魔芋的酶促褐变是生产和加工亟待解决的问题。研究发现,多酚氧化酶(PPO)是导致魔芋褐变的关键酶之一。本研究先采用同源克隆的方法,从花魔芋叶片中克隆得到PPO基因的保守编码区序列,并采用RT-PCR、RACE技术从花魔芋叶片中克隆得到PPO基因全长,以期掌握魔芋PPO基因的序列信息及其遗传背景,为通过转基因方法调控PPO基因表达,获得抗酶促褐变的新品种提供理论基础。主要试验结果如下：1、魔芋基因组DNA、不同组织的RNA提取与纯化方法的优化魔芋gDNA提取,CTAB提取缓冲液成分为：2%(W/V)CTAB、100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、1.4mol/LNaCl、20mmol/LEDTA、1%PVP(W/V),并加入β-巯基乙醇使终浓度为0.2%,样品迅速碾磨成粉末状溶解于提取液后,氯仿抽提两次,异丙醇和NaAC(3mol/L,pH5.2)使DNA沉淀,75%无水乙醇洗涤杂质2-3次,无水乙醇脱水,加双蒸水溶解沉淀得到DNA样品,-20℃保存备用。改良CTAB法能有效去除魔芋中的多糖、多酚等杂质污染,获得完整、纯净的DNA样品,可用于后续分子标记、资源鉴定、遗传图谱构建等研究。魔芋不同组织RNA提取,CTAB提取缓冲液主要成分为：2%(W/V)CTAB、100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mol/LNaCl、25mmol/LEDTA、2%PVP(W/V)、0.5g/L亚精胺,并加入β-巯基乙醇使终浓度为0.5%,样品迅速碾磨成粉末状溶解于提取液后,氯仿抽提两次,在RNA粗提取液中加入冷无水乙醇,吹打混匀后加至试剂盒自带的吸附柱中,力BufferRW1后离心,加BufferRW2后离心,用Rnase-freeH2O溶解得到RNA样品,-80℃保存备用。CTAB试剂盒相结合法,可有效去除魔芋中的多糖、多酚等杂质,获得完整、纯净的RNA样品,可直接用于后续的分子生物学操作(如半定量分析、RACE反应等)。2、采用同源克隆和RACE技术得到花魔芋PPO基因全长序列分别以花魔芋叶片gDNA和cDNA第一链为模板,用简并引物进行PCR扩增,得到该DNA和cDNA片段长度均为763bp,二者核苷酸序列相同,在保守区内无内含子翻译254个氨基酸残基。再利用5’RACE.3’RACE技术从花魔芋叶片中分别克隆得到5端和3’端序列,拼接获得魔芋PPO基因全长序列,其cDNA全长2026bp,完整的编码框为1452bp,编码484个氨基酸,5’端有384bp非编码区,3’端有190bp非编码区。核苷酸序列比对结果表明,魔芋PPO基因编码区序列与禾本科小麦(NCBI登录号：HQ228149.1)的相似度最高,达84%,与水稻(NCBI登录号：DQ532414.1)PPO的相似度达77%,与甘薯(NCBI登录号：AY822711.1)、马铃薯(NCBI登录号：U22922.1)PPO的相似度分别为76%、79%,与蔷薇科植物的相似度在74%-76%之间。编码区氨基酸序列比对结果显示,魔芋与凤梨科菠萝(GenBank登录号：AA016865.1)、睡莲科中国莲(GenBank登录号：ADP89908.1)、禾本科小麦(GenBank登录号：HQ228149.1)、蔷薇科苹果(GenBank登录号：BAA21676.1)等植物相似度分别为68%、63%、61%、59%。3、魔芋PPO基因编码蛋白结构分析采用生物信息学方法发现,魔芋PPO蛋白分子量约为55kD,pI为9.32,编码蛋白属于酪氨酸酶基因家族蛋白,具有PPO蛋白典型的特征。魔芋PPO中第91～108、250～261位氨基酸残基分别为CuA和CuB结合区,高度保守的CuA和CuB结合区富含His残基。魔芋PPO蛋白是亲水蛋白,无信号肽。氨基酸同源建模结果表明,该蛋白含有15个α-螺旋结构,5个β-折叠结构。系统绘制进化树表明,花魔芋PPO蛋白与禾本科植物(玉米、小麦、大麦)最先聚为一类,亲缘关系最近。
【作者】张洁；
【导师】张盛林；
【作者基本信息】西南大学，蔬菜学，2014，硕士
【关键词】魔芋；多酚氧化酶；克隆；序列分析；

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