凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）抗哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）感染的免疫应答特征研究

【摘要】凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）是我国主要的对虾养殖品种，具有重要的经济价值和粮食安全价值。但是凡纳滨对虾极易受到疾病如白斑病毒病和弧菌病等的侵害，严重影响和制约了其养殖产业的健康和可持续发展。因此，开展凡纳滨对虾抗病新品系的选育工作就显得十分必要，并具有非常重大的意义。本文的主要目的便是以凡纳滨对虾为研究对象，哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）为病原菌，研究对虾感染病原菌后的抗病病程特征及其主要免疫因子的抗病反应模式，并分析对虾免疫系统与其抗病性能的相关关系，发现对虾抗病免疫反应的关键参数，以期为对虾抗病选育提供免疫参考指标。为此，本文应用API20E微生物生理生化鉴定试剂盒、16SrRNA序列分析以及进化树分析等方法分离和鉴定了一株致病性哈维氏弧菌NJ1，并设计了一个三轮攻毒程序来筛选对菌株NJ1具有不同抗性的凡纳滨对虾，进而结合SPSS和AMOS数理统计分析软件对凡纳滨对虾抗哈维氏弧菌感染的病程特征，以及抗菌免疫反应特征和关键免疫参数进行了研究，获得了如下主要结果：1、致病性哈维氏弧菌的分离和鉴定。生理生化鉴定结果显示，菌株NJ1具有哈维氏弧菌一般特征，如能在TCBS培养基上生长、菌落呈绿色、0/129敏感、产生荧光等，16SrRNA序列分析结果显示菌株NJ1与V.harveyistrainLB4、persian1和S-16的16SrRNA序列高度相似，相似度均达99%，并且进化树分析也显示菌株NJ1与这3株菌聚在同一个分枝。致病性检测结果表明菌株NJ1对凡纳滨对虾具有致病性，可在被感染对虾中大量繁殖，致其死亡并发出荧光。2、凡纳滨对虾不同家系抗病性的检测。本文共测定了菌株NJ1对25个凡纳滨对虾家系的96h半数致死量（LD50），并以此作为衡量对虾抗病性能的强弱，将这25个家系分成4个对虾群体：高易感性家系群、中易感性家系群、低易感性家系群和抗病家系群。为研究对虾抗菌病程特征，对这4个对虾家系群肌肉注射菌株NJ1进行人工攻毒，结果显示，当注射1.0×105-1.0×107cfu/尾菌株NJ1时，高易感性对虾和抗病对虾开始死亡的时间分别为感染后1.5h-5.2h、2.7h-5.5h、5.2h-12.2h和6.2h-23.5h，达到最高死亡率的时间分别为感染后9.5h-31.3h、14.8h-27.7h、35.9h-42.5h和47.1h-47.5h，死亡高峰期分别是感染后2-12h、4-24h、12-24h和24-48h，死亡最剧烈时期分别为感染后2-12h、4-6h、4-24h和6-48h，死亡高峰期的累积死亡率分别为12.8%～42.1%、9.4%～44.5%、0%～26.1%和0%～16.4%，死亡最剧烈时期死亡速率分别为每小时2.1%～21.4%、0%～22.3%、0%～4.9%和0%～1.9%。另外，随着抗病性能的升高，对虾能够稳定地耐受病原菌各种强度的感染。当注射剂量从1.0×105cfu/尾升高到1.0×107cfu/尾，高易感性对虾和中易感性对虾死亡高峰期的出现时间均会提前，分别从6-12h和12-24h提前至2-4h和4-6h，但是低易感性对虾和抗病对虾死亡高峰期到来的时间在各种感染强度下一直分别稳定在12-24h和24-48h。3、抗哈维氏弧菌凡纳滨对虾的筛选。经过为期3个月左右的三轮攻毒筛选，对虾免疫能力得到显著提高，菌株NJ1对其6h、12h、24h、48h和96h半数致死量（LD50）分别提高14.9（P<0.01）、14.3（P<0.01）、8.4（P<0.01）、9.0（P<0.01）和9.4倍（P<0.01），并且获得了3群对菌株NJ1具有不同免疫能力的对虾，其6hLD50分别为1.4±0.1×107、1.1±0.1×107和6.2±0.2×106cfu/尾，而普通对虾则为8.8±0.4×105cfu/尾。4、凡纳滨对虾主要免疫因子抗哈维氏弧菌感染的免疫反应特征。对未经筛选的普通对虾和筛选得到的具有抗病性能的对虾进行人工攻毒，结果显示当肌肉注射1.0×105cfu/尾菌株NJ1后，筛选对虾和非筛选对虾分别在3h和12h将入侵血淋巴液病原菌清除干净，其THC和PO具有完全相同的反应模式，均分别从30min和3h开始显著下降，3h和12h降到最低值，24h和48h恢复到注射前水平，SOD分别从30min和3h开始显著下降，3h和12h降到最低值，48h和72h恢复到注射前水平，血蓝蛋白分别从30min和3h开始显著下降，3h和12h降到最低值，12h和48h恢复到注射前水平，抗菌活性分别从30min和6h开始显著下降，3h和12h降到最低值，24h和48h恢复到注射前水平。5、凡纳滨对虾免疫参数与其抗病性能相关关系的分析。本文结合SPSS和AMOS软件对凡纳滨对虾正常状态下THC，HEM浓度，以及血淋巴液、血淋巴细胞和肝胰腺的PRO、PO、SOA、NOS、GPX、CAT、SOD、BAC、LYS、ACP和AKP的活性，共35项免疫参数与其对哈维氏弧菌菌株NJ1抵抗力的相关关系进行了数理统计分析。结果发现，凡纳滨对虾的THC，HEM浓度，血淋巴液、血淋巴细胞和肝胰腺PO，血淋巴液PRO，血淋巴液和肝胰腺AKP，肝胰腺SOA，肝胰腺SOD和肝胰腺LYS等11项免疫参数与其抗病性能具有极显著的多元回归相关关系（P<0.01），对抗病性能的决定系数为91.1%。在这11项免疫参数中，肝胰腺中所有的免疫因子，如PO、AKP、SOA、SOD和LYS，对抗病性能均产生负效应，PO和AKP虽然在肝胰腺中对抗病性能产生负效应，但是在血淋巴液中却产生正效应。6、结论。凡纳滨对虾感染哈维氏弧菌后开始死亡和终止死亡的时间、死亡高峰期以及死亡最剧烈的时期等都会随着抗病性能增强而延迟，并且死亡高峰期的死亡率和死亡最剧烈时期的死亡速率也都会随着抗病性能增强而降低。感染哈维氏弧菌后，凡纳滨对虾抗病对虾和普通对虾的主要免疫因子表现出相同的抗菌免疫反应模式，先出现下降，最后又恢复到正常水平。凡纳滨对虾正常状态下关键免疫参数的活性水平能够很好地预测其抵抗哈维氏弧菌的能力，但是一种免疫因子在不同器官中对抗病性能具有不同的预测效应。综上所述，本文发现了抗病对虾具有一些不同于普通对虾的独特的抗菌感染病程特征和免疫反应特征，并筛选到了11项能够有效预测对虾抗病性能的免疫参数，为对虾抗病育种提供了一些具有重要价值的参考指标。
【作者】黄海洪；
【导师】刘小林；
【作者基本信息】西北农林科技大学，水生生物学，2014，博士
【关键词】凡纳滨对虾；哈维氏弧菌；病程特征；免疫反应模式；关键免疫参数；

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