番茄SpMPKs基因响应非生物胁迫的功能分析

【摘要】番茄作为世界第二大消费蔬菜，构成了世界农业生产中的一个大产业。全球水资源短缺以及设施栽培中土壤盐渍化造成的干旱、盐碱等非生物胁迫严重影响了番茄的生长发育以及果实品质。近年研究表明,促分裂素原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)级联反应在植物抗逆过程中发挥着重要作用，关于番茄MAPKs的研究鲜有报道。本试验以抗逆性强的L03708(Solanumpimpinellifolium)和敏感品种M82(Solanumlycopersicum)为材料，对干旱、盐和低温逆境胁迫下番茄SpMPK1/SlMPK1、SpMPK2/SlMPK2、SpMPK3/SlMPK3基因的表达模式，番茄病毒诱导基因沉默(virus-inducedgenesilencing，VIGS)沉默效率评价体系，以及番茄SpMPK1、-2、-3在感受ABA信号及耐干旱、高盐等逆境胁迫中的功能进行了研究。主要结果如下：1.分析了番茄SpMPK1/SlMPK1、-2、-3基因在非生物胁迫下的表达模式。干旱、盐和低温胁迫下，SpMPK1/SlMPK1,-2,-3基因的表达量随着处理时间先上调后下调，在表达高峰出现的时间和表达量上存在差异，但在24h之前都达到最高峰。20%PEG胁迫下，SpMPKs和SlMPKs在L03708和M82中的最高表达量与对照（0h）相比上升了约2-5倍，在L03708中SpMPKs表达量是M82中SlMPKs表达量的1.5-2倍；300mMNaCl胁迫下，MPK1和MPK3在两个材料中的最高表达量与对照（0h）相比上升了约2-5倍，SpMPK1和SpMPK3表达量分别是SlMPK1和SlMPK3表达量的2倍和2.5倍，而SlMPK2在M82中表达量持续下调；4°C低温处理下，MPK1和MPK2的最高表达量与对照（0h）相比上升约2-9倍，SpMPK1和SpMPK2表达量分别是SlMPK1和SlMPK2表达量的1.5和5倍，SpMPK3/SlMPK3在4°C低温处理12h后表达量最高，分别是对照的52和18倍。研究结果表明，干旱、盐和低温胁迫都诱导了MPK1,-2,-3基因的表达，且在醋栗番茄中的表达量高于栽培番茄。2.建立了番茄VIGS沉默效率评价体系。针对VIGS沉默效率不稳定的缺点，通过VIGS载体pTRV2对SpPDS（phytoenedesaturase）基因的沉默试验，提出了四个评价指标—植株沉默频率，植株沉默效率，叶片沉默频率和基因沉默效率，用于对VIGS沉默效率进行综合评价。结果表明：OD600为2.0时，SpPDS基因沉默效率最佳。用OD600为2.0的农杆菌菌液注射接种10d苗龄的番茄子叶，接种后第25天植株沉默频率达到97%，接种25-40天后第4-9片真叶沉默频率最高。3.利用VIGS技术在番茄上鉴定了番茄SpMPK1、-2、-3基因在非生物胁迫中的功能。SpMPK1、-2、-3基因单独沉默和SpMPK1/2与SpMPK1/2/3基因共沉默降低了番茄植株的耐旱性。100μMABA处理下，基因沉默植株叶片中H2O2的含量与正常植株相比增加了3-6倍；干旱胁迫下，基因沉默植株的成活率与对照相比降低了14-65%；SpMPK3基因单独沉默和SpMPK1/2与SpMPK1/2/3基因共沉默阻碍了ABA和H2O2诱导的气孔关闭，SpMPK1和SpMPK2基因单独沉默对气孔运动无影响。在ABA诱导气孔关闭调控番茄植株避旱过程中，SpMPK1与SpMPK2之间存在功能冗余，SpMPK1/2与SpMPK3存在基因功能重叠。4.用农杆菌介导的遗传转化法在拟南芥上鉴定了番茄SpMPK1、-2、-3基因在非生物胁迫中的功能。SpMPK1、-2、-3单基因过表达增强拟南芥在萌发期和生长期对非生物胁迫的耐受性。在萌发期，10%PEG和100、200mMNaCl胁迫下，转SpMPK1、-2、-3基因种子的萌发率保持在90%以上，而野生型种子萌发率分别降低为10%、31%和15%；0.5μMABA处理下，转SpMPK1、-2、-3基因种子的萌发率分别为30%、10%和2%，极显著低于野生型（86%），表明SpMPK1、-2、-3过表达增强了拟南芥对ABA的敏感性。在生长期，150mMNaCl和100μMABA处理拟南芥植株2h后，转基因植株叶片中O2-和H2O2含量与野生型相比降低50%；叶片离体6h后，转SpMPK1、-2、-3基因植株叶片失水率分别为67%、69%和68%，显著低于野生型（82%）；SpMPK1、-2、-3过表达还不同程度地增强了下游胁迫响应基因—RD29、RD22、RAB18，和转录因子—ZAT6、ZAT10、MYB44的转录活性。说明SpMPK1、-2、-3基因能够正向调控植物萌发期和生长期的抗渗透胁迫反应。
【作者】李翠；
【导师】梁燕；
【作者基本信息】西北农林科技大学，蔬菜学，2014，博士
【关键词】番茄；MAPK；非生物胁迫；VIGS；转基因；

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