地肤子皂苷对HepG2人肝癌细胞凋亡和迁移侵袭的影响及其作用机制研究

【摘要】肿瘤的发生发展是细胞增殖、生长、分化、代谢等调节失控的结果。细胞凋亡是机体在生长、发育和受外界刺激时，清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持机体内平衡的一种自我调节机制，受一系列基因激活、蛋白表达的调控，因此诱导细胞凋亡在预防和治疗恶性肿瘤中发挥着重要作用。此外，癌细胞极易浸润、迁移，形成转移瘤，因此癌症的治疗除了探索开发能够抑制癌细胞增长，有效杀死癌细胞的因子外，限制癌细胞转移侵袭也十分重要。地肤子皂苷来源于藜科一年生草本植物地肤子Kochiascoparia(L.)Schrad的果实。地肤子皂苷属于齐墩果酸3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷，是一种天然三萜皂苷。目前研究应用主要集中在其降糖，抗瘙痒、抗过敏，保护胃粘膜等功效方面，也有研究报道地肤子皂苷具有抑制四氯化碳导致的肝损伤的作用。但是对于地肤子皂苷的抗肿瘤活性国内外鲜有报道，因此，本课题以地肤子皂苷为研究对象，从诱导肝癌细胞凋亡和抑制肝癌细胞迁移、侵袭两方面探究其抗肿瘤活性，并进一步分析其诱导细胞凋亡和抑制癌细胞侵袭转移的分子机制。主要研究内容和结果如下：（1）研究地肤子皂苷对人肝癌细胞活力的影响，结果表明，地肤子皂苷抑制人肝癌细胞（HepG2、Huh7、Hep3B）的生长，并呈浓度和时间依赖关系，但地肤子皂苷的浓度控制在一定范围内（小于20μM）对正常肝细胞（HL7702、BRL-3A）无显著影响。进一步以HepG2细胞为模型，检测地肤子皂苷对细胞形态及凋亡的影响，结果显示，地肤子皂苷处理后的HepG2细胞收缩，变圆变小，染色质固缩，呈现典型的凋亡形态变化；激活型Caspase-3、PARP剪切增加，证实地肤子皂苷通过诱导人肝癌细胞凋亡抑制癌细胞生长。（2）以HepG2细胞为模型进一步探究地肤子皂苷诱导细胞凋亡的分子机制。试验结果显示，地肤子皂苷处理后，细胞促凋亡蛋白Bax表达上调而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，细胞线粒体膜电势（MMP）下降，线粒体细胞色素c释放增加，表明线粒体途径（内源性途径）参与地肤子皂苷诱导的细胞凋亡。地肤子皂苷显著抑制Akt、Erk1/2蛋白磷酸化，促进JNK、p38MAPK蛋白磷酸化激活；通过PI3K/Akt抑制剂（LY294002），激活剂（Insulin）和MAPKs抑制剂（SB203580、SP600125和U0126）进一步证实地肤子皂苷通过PI3K/Akt和MAPK信号通路调节Bcl-2家族成员（Bax和Bcl-2），进而导致线粒体功能紊乱，诱发细胞凋亡；同时也证实PI3K/Akt和MAPK通路之间存在相互抑制作用。地肤子皂苷处理后的人肝癌细胞，HO-1表达下降，iNOS表达升高，活性氧ROS产生增加。抗氧化剂NAC抑制活性氧，抑制了地肤子皂苷引起的线粒体细胞色素c释放，提高了HO-1蛋白水平，干预PI3K/Akt和MAPK通路。地肤子皂苷处理后，NO水平无显著变化，表明氧化应激参与地肤子皂苷诱导的细胞凋亡过程。地肤子皂苷下调COX-2蛋白水平，上调PPARγ、PGC-1α和FOXO4的表达。抑制或激活PI3K/Akt和MAPKs通路干预了地肤子皂苷对这些蛋白分子的调控作用。综上所述，地肤子皂苷通过刺激细胞发生氧化应激，调控PI3K/Akt、MAPK信号通路及其下游蛋白，导致线粒体功能紊乱，细胞色素c释放到胞质中，激活Caspase-3，PARP被剪切失活，从而诱导细胞凋亡。（3）研究地肤子皂苷对人肝癌上皮细胞HepG2黏附基质、迁移侵袭的影响。结果显示，地肤子皂苷抑制了HepG2细胞的纤维化拉长形变和细胞之间的脱离，地肤子皂苷处理后，细胞对模拟基质的黏附力明显降低，划痕-愈合能力减弱，采用transwell小室模型试验证明，地肤子皂苷抑制了癌细胞的迁移和侵袭。试验结果表明地肤子皂苷能够抑制人肝癌细胞黏附基质、迁移和侵袭。（4）在前期试验基础上，进一步分析地肤子皂苷抑制癌细胞基质黏附、迁移侵袭的分子机制。研究发现，地肤子皂苷下调血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、细胞间粘附分子-1（ICAM-1)和基质金属蛋白酶MMP-9的蛋白水平，诱导钙粘蛋白E-cadherin表达。地肤子皂苷通过影响PI3K/Akt和MAPK通路，干预VCAM-1、ICAM-1、MMP-9和E-cadherin的表达，发挥其抑制细胞黏附基质、迁移和侵袭的作用。地肤子皂苷抑制COX-2表达，促进PPARγ和PGC-1α的表达。抑制COX-2表达，进一步上调地肤子皂苷诱导的E-cadherin的表达；抑制PPARγ表达，地肤子皂苷对ICAM-1、MMP-9表达的抑制作用减弱，且完全抑制了地肤子皂苷诱导E-cadherin表达的作用。综上所述，地肤子皂苷通过PI3K/Akt和MAPK信号通路及下游分子COX-2、PPARγ等，抑制VCAM-1、ICAM-1和MMP-9蛋白水平，诱导E-cadherin表达，从而抑制细胞黏附基质、迁移和侵袭。
【作者】王静；
【导师】刘学波；
【作者基本信息】西北农林科技大学，食品科学，2014，博士
【关键词】地肤子皂苷；HepG2人肝癌细胞；凋亡；侵袭；信号通路；

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