异荭草素对HepG2人肝癌细胞凋亡和自噬的作用及机制研究

【摘要】肝癌是导致全球癌症死亡的第三大杀手；细胞凋亡和自噬与癌细胞生长密切相关，它们是受基因调控的、细胞自主的结束生命的行为，已成为目前治疗癌症的有效靶点；而运用食源性植物成分诱发细胞凋亡和自噬是干预癌细胞生长的有效措施。异荭草素，是天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等功能活性，且还具有抑制HepG2人肝癌细胞增殖的作用，但尚未见相关分子机制的报道。鉴于此，本论文以异荭草素为研究对象，从细胞凋亡和自噬两方面，在细胞水平探讨异荭草素抑制HepG2人肝癌细胞增殖的机制；并通过检测细胞内ROS，分析其在异荭草素抑制HepG2人肝癌细胞增殖过程中发挥的作用。本论文主要研究内容与结果如下：（1）研究异荭草素对三种人肝癌细胞HepG2、Hep3B和Huh7，以及HL-7702人肝细胞和BRL-3A鼠肝细胞增殖的影响。结果表明，异荭草素可显著抑制人肝癌细胞HepG2、Hep3B和Huh7增殖，并呈浓度和时间依赖性；80M异荭草素作用HepG2人肝癌细胞48h后，细胞活力分别显著（p<0.01）降低到79.58%，69.04%和45.49%。此外，在相同处理浓度和时间条件下，异荭草素对HL-7702人肝细胞和BRL-3A鼠肝细胞生长无显著影响。（2）探讨异荭草素对HepG2人肝癌细胞凋亡的作用及分子机制。结果显示，异荭草素使HepG2人肝癌细胞呈现细胞变圆，细胞核固缩，DNA片段化等典型凋亡特征。进一步研究表明，异荭草素可增加死亡受体Fas及其配体FasL的蛋白表达，继而激活半胱天冬氨酸蛋白酶-8（Caspase-8），剪切人BH3结构域凋亡诱导蛋白（Bid）形成有活性的t-Bid蛋白；另一方面，异荭草素可导致细胞线粒体膜电势下降、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）表达的升高、Bcl-2蛋白表达下降、细胞色素C从线粒体释放到细胞质、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）激活和多二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP）剪切。说明异荭草素可通过Fas受体调节的外源凋亡途径和线粒体调节的内源途径诱导细胞凋亡。细胞核转录因子（NF-κB）、肿瘤抑制基因（P53）、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路与细胞凋亡密切相关。结果显示，异荭草素可下调细胞中p-IκB、细胞核中NF-κB、p-Akt、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK1/2）蛋白表达，上调P53、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）和p-P38蛋白表达。采用NF-κB抑制剂（四氢吡咯二硫代氨基甲酯，PDTC）、P53抑制剂（Pifithrin-α）、PI3K/Akt抑制剂（LY294002）和MAPK抑制剂（U0126、SP600125和SB203580）分别作用细胞。结果表明，异荭草素可抑制NF-κB和PI3K/Akt信号通路激活，促进P53、p-JNK和p-P38蛋白高表达；并通过NF-κB、P53、PI3K/Akt和MAPK信号通路诱导线粒体调节的细胞凋亡。以上结果表明，异荭草素可激活Fas受体调节的外源凋亡途径，并通过调节NF-κB、P53、PI3K/Akt和MAPK信号通路，进而引起线粒体功能紊乱，Caspase-3激活，最终导致PARP片段化和细胞凋亡。（3）研究异荭草素对HepG2人肝癌细胞自噬的作用及分子机制。结果表明，异荭草素可促进细胞内自噬泡的形成，自噬特征蛋白Beclin-1和LC3高表达，并呈浓度和时间依赖性，导致HepG2人肝癌细胞发生自噬。采用NF-κB抑制剂（PDTC）、P53抑制剂（Pifithrin-α）、PI3K/Akt抑制剂（LY294002）和MAPK抑制剂（U0126、SP600125和SB203580）分别作用于细胞。结果显示，异荭草素可通过调节NF-κB、P53、PI3K/Akt和MAPK信号通路诱导HepG2人肝癌细胞发生自噬。为进一步验证异荭草素对HepG2人肝癌细胞自噬的作用，本研究运用自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤，3-MA）和激活剂（雷帕霉素）分别作用细胞。结果显示，3-MA可促进细胞增殖、增加线粒体膜电势、抑制异荭草素对Bax、激活型Caspase-3和PARP片段化的促进作用。凋亡抑制剂（ZVAD-fmk）可显著促进细胞增殖，抑制异荭草素对激活型Caspase-3和PARP片段化的促进作用，最终抑制异荭草素诱导的细胞凋亡；并且ZVAD-fmk可明显的抑制自噬特征蛋白Beclin-1和LC3表达。以上结果说明，异荭草素可通过诱导凋亡和自噬来抑制HepG2人肝癌细胞增殖；且凋亡和自噬同时存在，二者相互促进。（4）采用2’,7’-双氯荧光黄乙酸乙酯（H2DCFDA）染色，分别通过荧光显微镜和荧光酶标仪检测细胞内ROS水平。结果表明，异荭草素可显著增加细胞内ROS含量。另外，异荭草素可显著降低细胞内总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和谷胱甘肽（GSH）的活性，下调线粒体呼吸链复合物I（NADH脱氢酶）、III（细胞色素C还原酶）和IV（细胞色素C氧化酶）的蛋白表达量。说明异荭草素通过降低细胞内抗氧化物酶和呼吸链复合物活性，导致细胞内ROS水平增加。通过ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）处理细胞，结果表明，ROS作为上游刺激因子，通过调节NF-κB、P53、PI3K/Akt和MAPK信号通路导致HepG2人肝癌细胞凋亡和自噬。
【作者】袁莉；
【导师】刘学波；
【作者基本信息】西北农林科技大学，食品科学，2014，博士
【关键词】异荭草素；HepG2人肝癌细胞；凋亡；自噬；活性氧；

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