氟喹诺酮类药物多残留免疫学检测技术研究

【摘要】氟喹诺酮(fluoroquinolones,FQs)是第三代喹诺酮类药物，也是近20年来发展最快、研究最多的一类化学合成的抗生素，因其具有抗菌谱广、低毒、高效等特点,而广泛应用于人类临床与畜牧渔养殖业中。FQs类抗菌药为人兽共用药，动物体内药物残留通过食物链进入人体,对人类健康直接产生危害,可以导致细菌耐药性产生，并诱导癌变。因此，世界各国对FQs类抗菌药在动物源性食品中的残留制定了最高残留限量标准（10-1900μg/Kg）。由于FQs药物种类繁多，建立该类药物多残留检测方法有利于高效、快速的控制动物性产品质量安全，因此FQs药物多残留检测方法是目前的研究热点和趋势。基于此，本研究经过大量的试验，研制成功了FQs多残留检测试剂盒和胶体金免疫试纸。在分析FQs类药物分子结构和免疫原性基础上，采用二环己碳二亚胺（DCC）法将Nor（因Nor的结构是多种FQs类药物的母核结构）分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）进行连接制备免疫抗原（Nor-BSA）和包被抗原（Nor-OVA）。并利用紫外扫描、SDS-PAGE电泳及动物免疫等方法进行鉴定。结果表明，动物免疫产生的多抗血清能和FQs发生特异性反应，而与其他种类的药物不发生交叉反应。结合紫外扫描和SDS-PAGE电泳鉴定结果，证明Nor和载体蛋白成功偶联。为下一步FQs的抗体制备奠定了基础。用制备的Nor-BSA免疫新西兰大白兔，经过8次免疫后采血，采用间接ELISA测定多抗血清效价，阻断ELISA测定其敏感性及特异性。结果表明，兔多抗血清的效价在1:1.92×105至1:7.68×105之间；IC50最低为8.97μg/L；多抗血清能和FQs发生特异性反应，而与其他种类的药物不发生交叉反应。用制备的Nor-BSA免疫Balb/C小鼠，筛选出用于血清效价高的小鼠用于细胞融合，建立杂交瘤细胞株，利用杂交瘤细胞诱导腹水制备单抗并鉴定其性能。结果表明，共筛选出2株效价高、亲和力强的杂交瘤细胞1A3-D7和3E5-C6，染色体平均99条；制备的单抗亚型均为为IgG1/κ，腹水分别达到了1:2.56×105和1:1.024×106，Ka分别为3.63×109和3.86×109L/moL，3E5-C6产生的单抗IC50为5.50μg/L，单抗只和FQs发生特异性反应，而与其他种类的药物不发生交叉反应。基于所制备的FQsmAb，利用棋盘法确定FQsmAb、Nor-OVA及酶标抗体工作浓度，研制出FQs残留检测ELISA试剂盒并测定其性能。结果表明，所制备的两种ELISA试剂盒只和FQs发生特异性反应，而与其他种类的药物不发生交叉反应；经典阻断ELISA试剂盒的IC50为4.61μg/L，快速阻断ELISA试剂盒的IC50为6.27μg/L；两种试剂盒的准确度、精密度、保存期基本一致；与LC-MS-MS检测结果基本一致。基于所制备的FQsmAb，利用胶体金标记和膜免疫层析技术研制出FQs多残留检测试纸条并鉴定了其性能。结果表明，该试纸条对Nor和Pei的目测灵敏度为50ng/mL、对Lom的目测灵敏度为40ng/mL；试纸对Nor的机读灵敏度（B/B0＝80%）为2.519ng/mL、对Lom的机读灵敏度（B/B0＝80%）为1.533ng/mL、对Pei的机读灵敏度（B/B0＝80%）为2.394ng/mL；该试纸与其他抗生素无交叉反应；试纸检测50份阴性样品的假阳性率为0，检测72份阳性样品假阴性率为0；不同批次的试纸批内变异系数和批间变异系数均小于10%；试纸的有效期大于12个月；试纸的检测结果LC-MS-MS方法的检测结果基本一致。
【作者】邢广旭；
【导师】张改平；
【作者基本信息】河南农业大学，预防兽医学，2013，博士
【关键词】氟喹诺酮；完全抗原；单克隆抗体；ELISA试剂盒；胶体金免疫试纸；

【参考文献】
[1]沙言.火山岩堆积误释为生物礁[J].石油地球物理勘探,1993,03:379.
[2]杨玉海.轧机宽度预设定模型及控制方案[J].冶金自动化,1983,05:44-50.
[3]白秀然.钢铁交易系统银行接口的设计与实现[D].郑州大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[4]李鹏陶.尼龙69的合成与表征[D].浙江工业大学,2012.
[5]陈盼盼.双次级永磁同步直线电机定位力的分析与抑制[D].安徽大学,检测技术与自动化装置,2014,硕士.
[6]夏晶.从足球竞赛规则演变的视角探讨足球技战术的发展[D].山东体育学院,体育教学,2011,硕士.
[7]肖声忠.基于SQLServer2000的数据仓库的设计[J].职大学报(自然科学版),2005,04:64-65+63.
[8]李泽明.基于路径相似度测量的谱聚类算法研究[D].重庆大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[9]李大南.服务型号为国争光——三江航天集团型号标准化工作的研究与做法[J].质量与可靠性.2004(04)
[10]孟军海.铁路电务安全应急指挥系统研究[D].西南交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[11]彭柯.基于SCADA系统的原油管道泄漏检测关键技术研究[D].天津大学,精密仪器及机械,2004,硕士.
[12]关敬.基于PTS的OFDM峰均功率比抑制技术的研究[D].东北大学,通信与信息系统,2011,硕士.
[13]葛晴晴.基于BSC的我国物流企业绩效评价决策分析[D].黑龙江大学,情报学,2013,硕士.
[14]梅亚平.宝石新集团股份有限公司品牌个性塑造调研报告[D].浙江大学,新闻与传播,2013,硕士.
[15]龚蓉蓉.政治文化视野里的中国政治人格现代化的思考[D].苏州大学,政治学,2003,硕士.
[16]刘阳.堆载作用下黄土冲沟区桥梁桩基础竖轴向承载特性研究[D].长安大学,岩土工程,2014,硕士.
[17]苏彤.美国能源独立战略的实施及其影响[D].吉林大学,世界经济,2014,硕士.
[18]曹粲.杂质、缺陷及边缘修饰对锯齿型石墨烯纳米带输运性质的影响[D].中南大学,2012.
[19]戴意飞.海产品中生物胺高通量检测体系的建立与应用[D].浙江海洋学院,食品加工与安全（专业学位）,2014,硕士.
[20]袁子雄.平面缝隙螺旋天线研究[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[21]苏辛一,何光宇,张雪敏,连鸿波,张王俊,尹文君.配电网无功优化逐层筛选寻优算法[J].电力系统自动化,2010,21:40-45.
[22]骆嵩.SWI对脑梗死急性期缺血半暗带界定与PWI的对照研究[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[23]张祥晶.《等待野蛮人》中的创伤和见证[D].兰州大学,英语语言文学,2013,硕士.
[24]赵苑.国内商旅管理业务盈利模式研究[D].北京交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[25]王莉.基于改进模糊认知图的入侵检测方法研究[D].天津理工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[26]李佳.美国大报之奥巴马访华报道中的引语评价分析[D].河北师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[27]王学敏.早期《申报》与读者关系研究[D].山东大学,传播学,2013,硕士.
[28]姜瑞敏.探索博物馆解说系统[D].郑州大学,文物与博物馆学（专业学位）,2013,硕士.
[29]臧俊斌.集成光波导微环谐振腔的电光调制特性研究[D].中北大学,2013.
[30]刘强.大庆油田财务分析与评价研究[D].天津财经学院,2002.
[31]张平,徐滨士,韩文政,蔡其巩.新型Fe-Mn堆焊合金的抗接触疲劳性能的研究[J].焊接学报.1988(03)
[32]刘岩青.工程质量保险在房地产行业应用研究[J].项目管理技术,2014,12:81-85.
[33]孙丽丽.2005后的中考英语对教学的反拨效应研究[D].沈阳师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[34]徐秋慧.通过客户关系管理(CRM)再造电信企业营销[J].信息网络.2004(06)
[35]马晖男.文本信息检索中修饰语作用的研究[D].大连理工大学,系统工程,2004,硕士.
[36]沈煜.论医疗侵权纠纷的举证责任分配[D].苏州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[37]刘鹏飞.基于财务评价指标的数字保存项目经济评价研究[D].郑州大学,情报学,2013,硕士.
[38]陈起贤.TD-LTE系统接纳控制和负载均衡算法研究[D].北京邮电大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[39]杨渝华,李敏.基于改进遗传算法的成品油配送车辆调度问题研究[J].物流科技,2015,01:148-153.
[40]谭丽媛.氧化苯乙烯液相催化重排制备苯乙醛[D].天津大学,工业催化,2013,硕士.
[41]宋博.多智能体及其在板形控制中的应用研究[D].东北大学,控制理论与控制工程,2010,硕士.
[42]禤国锋.基于移动支付的第三方支付行业发展策略研究[D].北京化工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[43]白培中.西山煤田煤层气成藏条件及多煤层段压裂技术实验研究[D].中国矿业大学（北京）,工程力学,2009,博士.
[44]罗贺,杨善林,丁帅.云计算环境下的智能决策研究综述[J].系统工程学报,2013,01:134-142.
[45]陈秋永.中文数词数量和顺序加工的神经机制研究[D].苏州大学,基础心理学,2014,硕士.
[46]赵华.河北省高新技术企业自主创新能力的测度与分析[D].河北大学,数量经济学,2014,硕士.
[47]杨俭俭.DAM在报业的应用[J].中国报业,2002,09:67-68+66.
[48]刘月明.基于区域竞争力分析的工业园区产业规划研究[D].天津大学,公共管理,2013,硕士.
[49]刘玲.唤醒灵魂的教育[D].苏州大学,教育学原理,2014,硕士.
[50]张恋,李忠水,黄小妹,叶灵婷,林深.Pt/PEI-GN/PW_(12)_n复合膜的制备及其对甲醇氧化的电催化性能[J].功能材料,2014,07:7084-7088.