猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）非结构蛋白（nsp）1α抑制β干扰素转录的分子机理研究

【摘要】猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起机体免疫抑制和持续性感染，给养猪业造成巨大损失。研究PRRSV的免疫抑制机理，对于抑制PRRSV活性、减少PRRSV感染具有重要的理论指导意义。1.重组IFN-β抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制I型干扰素（IFN-α和IFN-β）是机体重要的抗病毒蛋白。前人的研究工作表明：加入IFN-β的MARC-145细胞，如果再感染PRRSV后，其并不发生细胞病变。但是目前尚不清楚：受PRRSV感染后的MARC-145细胞，如果再加入重组IFN-β，其是否会发生细胞病变。因此，本实验分别探讨了PRRSV感染前和PRRSV感染后的MARC-145细胞，再加入重组IFN-β后，其是否会发生细胞病变，从而来确定PRRSV感染后再加入的重组IFN-β是否具有抗病毒活性。结果表明：不同剂量PRRSV感染前已加入重组IFN-β的MARC-145细胞（Group1）、不同剂量PRRSV感染4小时后再加入重组IFN-β的MARC-145细胞（Group2）和不同剂量PRRSV感染8小时后再加入重组IFN-β的MARC-145细胞（Group3）在病毒感染后120小时均不发生细胞病变；而对于不同剂量PRRSV感染后24小时再加入重组IFN-β的MARC-145细胞（Group4），仅高剂量感染PRRSV的细胞,发生了细胞病变。并且，PRRSV核衣壳蛋白（N）的间接免疫荧光结果显示：Group1、2、3的高剂量(10MOI)PRRSV感染的细胞有少量N蛋白阳性细胞，但其数量在感染进程中并无明显增加，而Group1、2、3低剂量PRRSV感染的细胞均没有N蛋白阳性细胞。另外，Group1中高剂量感染PRRSV(10MOI)的荧光数量远远低于Group2，而Group2又低于Group3。以上结果表明：重组IFN-β对PRRSV具有良好的抗病毒活性，即PRRSV感染前和PRRSV感染早期加入的重组IFN-β均能抑制高剂量感染的PRRSV；PRRSV感染前后加入的重组IFN-β均能清除低剂量感染的PRRSV。2.第176位氨基酸和锌指结构在nspα抑制IFN-β转录中发挥重要作用PRRSV的非结构蛋白（nsp）1α含有三个结构域：N端锌指结构（ZF）（1-65aa）、木瓜样蛋白酶结构域（66-166aa）和C端延伸区（167-180aa）。前人的研究工作表明：nsp1α能够抑制由poly(I:C)诱导的IFN-β转录；nsp1α的木瓜样蛋白酶结构域的酶活性和C端延伸区是nsp1α抑制干扰素转录所必须的。但是，目前尚不清楚：C端延伸区的最短区域以及哪个氨基酸在nsp1α抑制干扰素转录过程中发挥重要作用；N端锌指结构是否是nsp1α抑制干扰素转录所必须的。因此本实验首先逐个截短nsp1α（共180个氨基酸）C末端的14个氨基酸，实验结果表明：nsp1α1-176、nsp1α1-177和nsp1α1-179均能抑制poly(I:C)或信号蛋白(VISA、TRIF、IKK-ε)诱导的IFN-β转录活性，而nsp1α1-174和nsp1α1-175却不能抑制poly(I:C)或信号蛋白(VISA、TRIF、IKK-ε)诱导的IFN-β转录活性；pIRF-3（磷酸化IRF-3）是IFN-β最重要的转录因子，nsp1α1-176、nsp1α1-177和nsp1α1-179均能抑制poly(I:C)或信号蛋白(VISA、TRIF、IKK-ε)诱导的pIRF3结合序列的报告质粒活性，而nsp1α1-174和nsp1α1-175均不能抑制poly(I:C)或信号蛋白(VISA、TRIF、IKK-ε)诱导的pIRF3结合序列的报告质粒活性。该实验结果表明：167-176位氨基酸是nsp1α抑制IFN-β转录所需CTE的最小区域以及第176位氨基酸可能在nsp1α抑制IFN-β转录中起着重要作用。nsp1α第176位氨基酸的缺失和突变实验发现：缺失和突变第176位氨基酸后的nsp1α均不能抑制poly(I:C)或信号蛋白(VISA、TRIF、IKK-ε)诱导的IFN-β转录活性和pIRF3结合序列的报告质粒活性。删除nsp1α的N端ZF后发现：缺少ZF结构的nsp1α不能抑制poly(I:C)或信号蛋白(VISA、TRIF、IKK-ε)诱导的IFN-β转录活性，也不能抑制由信号蛋白(VISA、TRIF、IKK-ε)所诱导的IFN-β启动子活化以及pIRF3结合序列的报告质粒活性。nsp1α的晶体结构显示nsp1α的N端锌指结构是4个半胱胺酸结合位点的ZF家族，即Cys8、Cys10、Cys25和Cys28可以与锌离子结合，将其中任何一个半胱氨酸突变就会破坏ZF结构。通过点突变技术，发现：ZF结构突变后的nsp1α不能抑制poly(I:C)或信号蛋白(VISA、TRIF、IKK-ε)诱导的IFN-β启动子活化，也不能抑制Poly(I:C)或信号蛋白(VISA、TRIF、IKK-ε)所诱导的pIRF3结合序列的报告质粒活性；仅ZF结构不能抑制poly(I:C)或信号蛋白(VISA、TRIF、IKK-ε)诱导的IFN-β启动子活化，也不能抑制Poly(I:C)或信号蛋白(VISA、TRIF、IKK-ε)所诱导的pIRF3结合序列的报告质粒活性。以上结果表明：nsp1α的第176位氨基酸和nsp1α锌指结构在nspα抑制IFN-β转录中发挥重要作用。3.nsp1α与HnRNPA2/B1蛋白相互作用前期实验证明PRRSV非结构蛋白（nsp）1α与nsp11能抑制β干扰素转录，且文献报道nsp1α与nsp11对PRRSV的毒力也有一定的影响，但是其机理目前尚不清楚。本实验以蛋白相互作用为出发点，即分别以nsp1α和nsp11为诱饵，经免疫共沉淀、SDS-PAGE电泳、银染和质谱测序，初步确定了可以与nsp1α和nsp11相互作用的蛋白质，继而探讨该蛋白在β干扰素转录信号通路中的作用和对PRRSV毒力的影响。免疫共沉淀和质谱测序显示：HSP60、WDR77以及HnRNPA2/B1是nsp1α互相作用的候选靶蛋白，而eIF4A和PDIA6可能是与nsp11相互作用的候选靶蛋白；进一步的免疫共沉淀分析发现：只有HnRNPA2/B1与nsp1α相互作用，HnRNPA2/B1的过表达可以明显增强PRRSV的毒力,但并不影响β干扰素转录信号通路，因此，HnRNPA2/B1可能是通过作用于干扰素以外的机理来影响PRRSV的毒力。结论：（一）重组IFN-β对PRRSV具有良好的抗病毒活性；（二）167-176位氨基酸是nsp1α抑制IFN-β转录所需CTE的最小区域，第176位氨基酸和锌指结构在nspα抑制IFN-β转录中发挥重要作用；（三）HnRNPA2/B1与nsp1α相互作用，而HnRNPA2/B1可能是通过作用于干扰素转录以外的机理来影响PRRSV的毒力。
【作者】史西保；
【导师】张改平；
【作者基本信息】河南农业大学，预防兽医学，2014，博士
【关键词】猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）；IFN-β；nsp1α；176位氨基酸；锌指结构（ZF）；HnRNPA2/B1；

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