肌球蛋白轻链激酶通过维持细胞膜张力影响平滑肌细胞的前伸和迁移

【摘要】细胞迁移,作为一个时间和空间上高度协调的连续循环步骤,在许多重要的生物学过程中起基础作用,如血管新生、组织修复、免疫应答和炎症、癌细胞侵袭和转移等。一个被普遍接受的细胞迁移模型主要包括这样几个步骤：细胞外环境中的促迁移或趋化因子诱导启动细胞极化;紧接着肌球蛋白活性相关的肌动蛋白聚合驱动细胞前沿产生突出;然后整合蛋白介导的粘附结构装配促使细胞前端附着到细胞外基质；最后,伴随着细胞后端的粘着斑分解,肌动球蛋白收缩拉动细胞尾部,于是细胞发生位移。其中肌动球蛋白介导的收缩依赖于Ⅱ型肌球蛋白调节轻链的磷酸化。多年来,肌球蛋白轻链激酶(MLCK),一个钙离子/钙调蛋白依赖的专一磷酸化肌球蛋白调节轻链的蛋白激酶,被认为在细胞迁移中发挥关键作用,特别是通过产生必要的收缩力促进细胞迁移。已发表的论文表明阻断MLCK活性会削弱细胞迁移。但是,这一结论大都是基于具有非特异性的化学抑制剂的MLCK阻断实验。由于细胞迁移过程包含了众多的影响因素和时间空间上协调组织好的步骤,MLCK在其中的确切作用仍然是一个有待证实的复杂课题。在这篇论文中,我们原代培养了MLCK缺陷型(敲除)小鼠肠道平滑肌细胞,然后研究了其在细胞形态和迁移特性上的改变。出乎我们的意料,相对于对照组细胞在培养的第七到第九天才开始迁移出组织块,MLCK缺陷型的平滑肌细胞早在第四天就开始向组织块外迁移。而且,我们观察到MLCK缺陷型的平滑肌细胞展现出增强的伪足和显著增加的细胞铺展和迁移的速度。在其前沿,伪足更加发达并且延伸速度更快(平均每30分钟伪足延伸距离：敲除组：21.9±1.9μmvs对照组：15.0±2.2gm,p<0.05)。在细胞接种60分钟后,MLCK缺陷型的平滑肌细胞显示出更大的铺展面积(敲除组：20110±1642μm2vs对照组：8457±880μmn2,p<0.0001)。定量分析创口愈合实验也显示,MLCK缺陷型的平滑肌细胞表现出更远的平均每小时迁移距离(敲除组：55.3±2.5μmvs对照组：19.3±1.7μm,p<0.001)。我们还意外的发现原代培养的MLCK缺陷型的平滑肌细胞中的肌球蛋白调节轻链磷酸化水平没有发生显著变化。另外,牵系力测量显示突变后的细胞中细胞膜张力降低,表现出膜运动增强和表层丝状肌动蛋白(F-actin)减少。利用修复救援实验,我们证实,不稳定的膜底丝状肌动蛋白和细胞前沿位置的肌动蛋白丝聚合作用这两者对于细胞前伸步骤的起始形成都是必不可少的。更进一步的纤连蛋白结合沉淀实验表明,MLCK具有对纤连蛋白-整合蛋白-细胞骨架复合体的结合活性。这个结果为MLCK定位于细胞膜附近并起到稳定表层肌动球蛋白细胞骨架作用提供了初步的分子依据。综上所述,我们的研究发现了MLCK的一个新的作用机制,其可以通过被纤连蛋白-整合蛋白-细胞骨架复合体招募定位,通过影响表层丝状肌动蛋白骨架的稳定控制细胞膜张力,进而调节细胞的前伸和迁移过程。由此我们得到一个结论,MLCK可以不依赖于肌球蛋白调节轻链磷酸化,而作为丝状肌动蛋白聚束蛋白,在细胞前伸前保持细胞膜张力在一个较高的水平,从而制约细胞起始迁移。这一发现揭示了一种新的基于细胞膜张力的细胞迁移调节机制,并可能为如肿瘤转移这类细胞迁移相关的疾病的治疗方法提供新的突破口。
【作者】陈晨；
【导师】朱敏生；
【作者基本信息】南京大学，生物学（专业学位），2012，博士
【关键词】肌球蛋白轻链激酶；平滑肌细胞；细胞迁移；丝状肌动蛋白；膜突出；膜张力；

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