单核细胞增生性李斯特菌适配子的筛选及其初步应用

【摘要】单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,简称单增李斯特菌)是一种胞内寄生菌,在自然环境中广泛存在,且对不良环境抵抗力较强,甚至在4℃也能生长繁殖,可以污染多种食品导致食源性疾病,其致死率高达20%以上,因此受到世界范围的普遍关注,各国政府都制定了严格的防控措施和食品安全限量标准。单增李斯特菌检测方法可分为4大类：分离培养、免疫学方法、分子生物学技术和仪器分析法。其中免疫学方法在微生物快速检测中的地位毋庸置疑,它主要以抗原抗体反应为基础,因此抗体是免疫学方法中的核心试剂。但是免疫学方法使用过程中人们发现了抗体存在的一些不足,例如生物抗体存在获取耗时、不易保存、批次不稳定等缺陷。随着科学技术的发展,有学者发现了一种与抗体具有相似功能的新型配体–适配子。它相比于生物抗体具有便于修饰、性质稳定、可以无限合成等优势,已经成为医学领域和生物学领域的研究热点。许多研究证明适配子有望替代生物抗体应用于临床治疗和微生物检测技术。本文通过筛选获得能够与单增李斯特菌特异性结合的ssDNA适配子,并采用酶联配体吸附法(Enzyme-LinkedAptamerSorbentAssay,ELASA)对适配子应用于检测方法的能力进行了初步探索。首先体外合成全长为85bp的ssDNA文库,该ssDNA两端为引物序列,中间含有40bp随机序列。以单增李斯特菌为靶标,采用指数富集配基的系统进化(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,SELEX)技术从ssDNA文库中筛选能与单增李斯特菌特异性结合的ssDNA,共进行15轮筛选。每轮筛选的次级文库利用亲和素标记的引物进行扩增,以链霉亲和素磁珠回收目标扩增产物。同时每轮筛选的次级文库利用地高辛标记的引物进行扩增,扩增产物与单增李斯特菌结合,通过抗地高辛抗体碱性磷酸酶显色系统测定次级文库与单增李斯特菌的结合力,以OD405nm表示。结果显示链霉亲和素磁性微球可以有效回收目的DNA,提高筛选效率。ssDNA与单增李斯特菌的结合力从第1轮的OD405nm为0.051逐步提高,到15轮筛选之后OD405nm提高到0.69。通过对获得的适配子克隆测序获得了23条适配子序列,序列比对发现适配子的一级结构的同源性不高,最长的有7个碱基同源。通过RNAstructure软件对23条适配子二级结构进行了分析预测,根据二级结构的相似性可以分为4个家族。23条适配子与单增李斯特菌的亲合力进行了测定,结果显示结合能力较高的6条适配子中有4条属于第4家族。选取21号和35号适配子与其它单增李斯特菌反应,结果显示21号和35号适配子具有较好的特异性。选取亲和力较强的适配子建立夹心ELASA来检测单增李斯特菌。亲和素标记的适配子与链霉亲和素结合被吸附到酶标板上,作为捕获配体,加入待检样品,洗涤后加入另一条亲和素标记的配体,辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合,加入TMB底物进行显色,测定OD450nm。通过实验对反应体系进行优化,结果显示链霉亲和素以6μg/mL采用干法包被酶标板效果较好,捕获适配子的浓度为40nmol达到饱和,酶促反应最佳显色时间为15min。将培养的细菌液作10倍倍比稀释后测定该方法的灵敏度,结果显示该方法对单增李斯特菌最低检测浓度为104CFU/mL。用ELASA法检测李斯特菌属内和非李斯特菌属的细菌,结果显示以P/N值≥2.1作为阳性的判断标准,可以特异地检测单增李斯特菌。并用该方法检测人工污染牛奶样品,通过8h的增菌,可以检测出单增李斯特菌。本研究通过SELEX筛选获得23条单增李斯特菌适配子,选取2条适配子应用于夹心ELASA检测方法,结果显示该方法能够特异性地检测单增李斯特菌,而且具有较好的灵敏度,这充分显示适配子作为新型配体在检测中应用的巨大潜能,也为其它病原微生物适配子筛选和检测提供借鉴。
【作者】徐宝霞；
【导师】吴仁蔚；
【作者基本信息】华中农业大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】单增李斯特菌；适配子；SELEX；ELASA检测方法；

【参考文献】
[1]张健,姜继海,白云峰,李艳杰.气穴中液压油温度随气泡膨胀变化规律[J].哈尔滨工程大学学报,2015,04:.
[2]甘义锋.农村义务教育阶段物理教师素质发展研究[D].华中师范大学,学科教学,2013,硕士.
[3]徐瑞廷.民事诉讼立案调解制度研究[D].内蒙古大学,法律,2013,硕士.
[4]顾寅.“私人语言”论证在维特根斯坦后期哲学中的意义[D].安徽大学,外国哲学,2013,硕士.
[5]马畅.风险信息类型、时间和情绪对环境风险认知的影响[D].吉林大学,基础心理学,2014,硕士.
[6]郭薇.我国货币政策的房地产价格传导效应分析[D].山西财经大学,金融学,2013,硕士.
[7]马爱存.“小男人”群像研究[D].华东师范大学,电影学,2013,硕士.
[8]刘平.新世纪以来70后“美女作家”的创作提升[D].华中师范大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[9]于永学.煤矿综合信息平台系统的设计与实现[D].天津大学,软件开发,2012,硕士.
[10]邓宗才,王海忠,程舒锴.基于修正压力场理论的超高性能钢纤维混凝土柱抗剪承载力[J].北京工业大学学报,2015,04:573-578.
[11]郭一楠,王素川,郝榕,谭得健.多层控制在焦炉回炉煤气压力控制中的应用[J].冶金自动化,2000,02:13-15.
[12]许少峰.鞍山环卫局党务管理系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[13]高淑怡.百合总皂苷质量标准研究及抗抑郁伴肠易激综合征的作用初探[D].广州中医药大学,中药学,2013,硕士.
[14]张永建.68例急性缺血中风动脉机械取栓患者的临床资料回顾研究[D].广州中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[15]李雪飞.鞘内注射甘珀酸对腰5脊神经切断大鼠双侧痛觉高敏的影响及机制研究[D].南方医科大学,麻醉学,2012,硕士.
[16]王金娟.基于颜色特征的图像检索技术研究[D].湖南大学,软件工程,2010,硕士.
[17]乔丽.纳米结构硅/碳复合材料的制备及其储锂性能的研究[D].兰州大学,2013.
[18]马征征.基于蒙特卡罗的移动节点定位算法研究[D].河北师范大学,无线电物理,2013,硕士.
[19]张浩.泛在无线信号定位技术的优化研究[D].北京交通大学,2014.
[20]马佳瑶.自动词使役句和使役性他动词句的对比研究[D].上海外国语大学,日语语言文学,2012,硕士.
[21]何明恕.补肾理气活血法治疗肾虚型卵巢储备功能下降的临床观察[D].广州中医药大学,中医妇科学,2013,硕士.
[22]王谦林.情景复现教学法在中学历史课堂中的应用[D].西北师范大学,教育,2013,硕士.
[23]胡肖一.高烈度区掉层结构的隔震设计探索[D].重庆大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[24]叶国伟.HK公司冰箱新产品开发流程优化研究[D].华南理工大学,工业工程,2012,硕士.
[25]宋杰.生物可降解聚乳酸（PDLLA）的合成及性能表征[D].武汉理工大学,材料学,2004,硕士.
[26]钱良.含氮杂环硼酸酯衍生物的摩擦学性能及其水解稳定性研究[D].华东交通大学,应用化学,2013,硕士.
[27]简晓莉.复方香连涂膜剂的制备与质量标准研究[D].广州中医药大学,中药学,2013,硕士.
[28]弥旭锋.基于光纤Bragg光栅传感技术的锚杆应力分布规律研究[D].西安科技大学,采矿工程,2013,硕士.
[29]栗树和.发展CRM,应对入世挑战[J].中国电子商务,2001,24:32-35.
[30]罗林.Granger因果模型的定阶和参数估计方法探讨[D].华中师范大学,概率论与数理统计,2014,硕士.
[31]杨萍,丁健忠,马春,夏林悬,丁期峰,何杰.绿色合成金颗粒负载石墨烯复合材料及其电催化性能研究[J].宿州学院学报,2014,12:79-81+91.
[32]贺文丽.全麻诱导期老年患者靶控输注舒芬太尼和丙泊酚的临床研究[D].南方医科大学,麻醉学,2012,硕士.
[33]梁美华.促销员激励核心因素的理论和实证分析[D].首都经济贸易大学,劳动经济学,2004,硕士.
[34]马世国.强降雨条件下基于Green-Ampt入渗模型的无限边坡稳定性研究[D].浙江大学,岩土工程,2014,博士.
[35]赵继民.表面物理的超快光谱学研究[J].现代物理知识,2012,01:44-46.
[36]李杰.城市地下管线探测技术及质量控制研究[D].中国地质大学（北京）,测绘工程,2013,硕士.
[37]吴征宇.电动负载模拟器控制系统的设计[D].大连海事大学,电气工程,2013,硕士.
[38]高昶.基于任务驱动的分层分组教学法在初中信息技术课中的应用[D].山东师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[39]汪叶林.戰國、秦代出土簡帛法律文獻研究[D].安徽大学,漢語言文字學,2013,硕士.
[40]王友光.除尘器集散式清灰控制系统的设计及应用[J].冶金自动化,2013,01:66-69.
[41]陈伟彬.聚碳酸亚丙酯型聚氨酯材料的合成[D].广东工业大学,高分子化学与物理,2014,硕士.
[42]陆友桂.客户价值驱动型企业管理模式研究[D].东南大学,2005.
[43]程大千.稻秆流化床气化及灰渣热物性实验研究[D].南京师范大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2012,硕士.
[44]刘耀和,胡宝清.模糊关联规则及其挖掘算法[J].应用科学学报,2003,04:373-376.
[45]于艾清,顾幸生.基于粗糙规划的不确定加工时间的并行机调度[J].控制与决策,2008,12:1427-1431.
[46]温浩宇,任小龙,徐国华.制造网格的搜索算法研究[J].中国机械工程,2004,22:40-43.
[47]芦爽.济南旧城区开敞空间控制指标规划研究[D].山东建筑大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[48]代应辉.大鼠高眼压视网膜缺血再灌注损伤实验研究及神经营养素受体p75的表达与意义[D].安徽医科大学,眼科学,2003,硕士.
[49]王强.基于FPGA的OFDM通信系统的同步方式研究与实现[D].北京交通大学,2007.
[50]刘全军.微细扁线材恒张力收线系统开发及工艺研究[D].广东工业大学,机械设计制造及其自动化,2013,硕士.