砷甲基化过程中S-腺苷甲硫氨酸和砷与人砷甲基化酶结合位点的研究

【摘要】无机砷(iAs)的甲基化是其在生物体内代谢的重要过程。在还原剂的协同作用下,砷甲基化酶(AS3MT)催化甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和iAs进行甲基转移反应从而完成iAs的代谢。本文研究了甲基供体SAM和As在人砷甲基化酶(hAS3MT)中的结合区域及位点,运用同源建模和定点突变技术、酶动力学及光谱学等实验方法系统研究了hAS3MT中可能与SAM结合的酸性氨基酸残基(Asp76、Asp84、Asp102和Asp150)以及距SAM5A范围内的氨基酸残基的作用,进一步研究了hAS3MT中Cys残基在砷甲基化反应中的作用,从而确定了iAs与hAS3MT的第三个结合位点。综合实验结果和WT-hAS3MT-SAM-As同源模型分析结果,我们推测了hAS3MT催化甲基由SAM转移到iAs的机制。主要工作如下：(1)通过比对多种SAM依赖的甲基化酶的蛋白质序列推测出hASSMT中与SAM结合相关的区域：基序I(74-ILDLGSGSG-82)、基序Ⅱ(101-IDMT-104)和基序Ⅲ(147-ESHDIVVSN-155)。为了研究基序中或基序附近保守的酸性氨基酸的作用,选择基序Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中的Asp76、Asp102、Asp150和靠近基序Ⅰ的Asp84残基,运用定点突变技术得到了突变体D76P、D76、D84P、D84N、D102P、D102N、D150P和D150N,通过高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)、圆二色谱(CD)和衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)研究了突变体结构与功能的关系；以红藻砷甲基化酶(CmArsM)的晶体结构为模板,用modeller9v8建立了野生型hAS3MT(WT-hAS3MT)和hAS3MT各突变体的模型。结果显示除突变体D150N外,其他突变体都失去了催化活性；与WT-hAS3MT相比,所有突变体的构象都发生了变化。运用荧光滴定法测定了hAS3MT与SAM之间的解离常数Kd值,与WT-hAS3MT和SAM之间的Kd值相比,突变体和SAM之间的Kd值均增大,表明突变体与SAM的亲合力都降低了。以上实验结果以及hAS3MT-SAM的模型显示Asp102与SAM核糖上的羟基形成了两个键长分别为2.037A和2.081A的氢键,从而促进了SAM与hAS3MT的结合；基序Ⅰ中的Asp76和基序Ⅰ附近的Asp84可能通过水分子间接地与SAM形成了氢键；Asp150通过影响SAM与hAS3MT结合的微环境,从而影响了hAS3MT的催化活性。(2)WT-hAS3MT-SAM的模型显示距SAM5A范围内的氨基酸残基为：57-RYYG-60,76-DLGSGSGRD-84、101-IDMT-104、Q107、134-GYIE-137、155-NCV-157、160-LV-161和C206,其中残基D76、D84、D102、C156和C206的作用已有研究。为了研究距SAM5A范围内其余氨基酸残基的作用,我们利用定点突变方法得到了23个突变体：R57A、Y58A、Y59A、G60A、L77A、G78A、S79A、G80A、S81A、G82A、R83A、I101A、M103A、T104A、Q107A、G134A、Y135A、I136A、E137A、N155A、V157A、L160A和V161A,并研究了各突变体结构和功能。结果显示：57-RYYG-60、76-DLGSGSGRD-84、101-IDMT-104、34-GYIE-137、155-NCV-157和160-LV-161共同形成了SAM的结合区域；57-RYYG-60、78-GSGSG-82和155-NCV-157与SAM的甲硫氨酸有相互作用；101-IDMT-104和135-YIE-137与SAM的核糖腺苷有相互作用；C156和L160在甲基转移过程中起着至关重要的作用；G78、G80、G82位于连接hAS3MT中p-股1和α-螺旋的连接环内,与SAM的结合密切相关;Y58、Y59、N155、C156和L160在S+-CH3向As的孤对电子靠近时固定S+-CH3,并在甲基转移过程中起重要的作用；G78、D102、M103.T104、1136和N155与SAM形成氢键。(3)hAS3MT中有14个半胱氨酸(Cys)残基(Cys32、Cys61、Cys72、Cys85、Cys156、Cys206、Cys226、Cys250、Cys271、Cys334、Cys360、Cys368、Cys369和Cys375),其中Cys32、Cys61、Cys156和Cys206是保守的。除Cys32、Cys61口Cys85外,其他Cys残基的作用已有研究。无机亚砷酸(iAsⅢ)易与三个Cys残基的巯基结合,且已经确定了iAsⅢ在CmArsM上的第三个结合位点是Cys72,该残基对应于hAS3MT的Cys61位点。目前的研究只确定了两个iAsⅢ与hAS3MT的结合位点(Cys156和Cys206),而iAsⅢ在hAS3MT中的第三个结合位点尚不清楚。为此,通过定点突变技术得到了突变体C32S、C61S和C85S,并研究了它们的结构与功能的关系。结果显示与WT-hAS3MT相比C85S的催化活性略有降低,C32S和C61S虽不能催化iAsⅢ甲基化但可以催化一甲基亚砷酸(MMAⅢ)甲基化,而C156S和C206S完全失去了催化iAsⅢ和MMAⅢ甲基化的能力,这说明Cys32、Cys61、Cys156和Cys206在第一步砷甲基化(iAsⅢ到一甲基砷酸(MMA))中都是必需的,而只有Cysl56和Cys206在第二步砷甲基化(MMAⅢ到二甲基砷酸(DMA))中是必需的。另外通过WT-hAS3MT-SAM-As的模型分析发现Cys32与As之间的距离比Cys61与As之间的距离远得多,从而推测Cys61是iAsⅢ与hAS3MT的第三个结合位点。WT-hAS3MT-As和WT-hAS3MT-SAM-As的模型显示SC61和As之间的距离分别为7.5A和4.1A,说明SAM结合到hAS3MT上后缩短了SC61和As之间的距离,从而促进了As与hAS3MT的结合。这与前人的研究结果“SAM是第一个结合到hAS3MT上的反应物而砷是第二个”是一致的。在确定了As与hAS3MT的结合位点及SAM和hAS3MT结合区域的基础上,结合WT-hAS3MT-SAM-As模型分析结果,我们推测了hAS3MT催化甲基由SAM转移到As上的机制。
【作者】李响利；
【导师】王志林；
【作者基本信息】南京大学，无机化学，2014，博士
【关键词】无机砷；人砷甲基化酶；SAM的结合区域；砷的结合位点；半胱氨酸残基；同源建模；

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