三氧化二砷联合阿克拉霉素对人类急性髓系白血病细胞的协同致死作用及斑马鱼白血病异种移植模型的建立

【摘要】三氧化二砷(AS2O3,ATO)作为自然界砷复合物的一种有效成分己被广泛应用于急性早幼白血病(APL)的治疗,现已证实该药对急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)具有非常显著的疗效,最近的研究表明As2O3不仅对血液系统的恶性肿瘤有效,对其它肿瘤如乳腺癌、多发性骨髓瘤、神经细胞瘤等有也具有非常好的效果,但是其具体作用机制直到今天还不十分清楚,有研究报道As2O3可能是通过抑制肿瘤细胞增殖和血管发生；还有研究报道As2O3的抗肿瘤作用是由于它与某些药物联合后可以诱导肿瘤细的分化,除了上述观点外,大部分观点认为As2O3通过调节细胞内外多种信号途经从而诱导细胞凋亡的发生。在凋亡过程中存在多种基因的调控作用,与凋亡密切相关的基因有Survivin、P53、Bcl-2等。研究表明,AS2O3可下调Bc1-2基因水平导致肿瘤细胞凋亡。我们知道,细胞凋亡(apoptosis)是一种有序的或程序性的细胞死亡方式,是受基因调控的细胞主动性死亡过程,由于它保证多细胞生物的健康生存过程中的重要性,引起了人们对其途径的广泛深入的研究,成为目前生命科学研究的热点之一。目前认为细胞凋亡的发生主要有以下途经(图1)：(1)细胞外途经：也称为死亡受体(DR)途经,DRs是一类跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员,其中包含功能性受体和假性受体(DcR),这两种类型的受体的胞外区都有一段富含半胱氨酸的区域(CRD),但是只有功能性受体的胞内区才具有蛋白水解功能,称为“死亡区域(DD)”。目前认为受体超家族成员包括TNF-R1、Fas/APO1、DR3、TNF-相关的凋亡诱导配体受体-1(TRAIL-R1,DR4),-2(TRAIL-R2,DR5)和DR6。其它受体还有]TNF-α受体、FasL/APO1/CD95受体、以及TRAIL/APO2L受体等。这些受体能调节其它的生理功能如细胞的代谢、增殖和细胞因子的产生。促凋亡配体是一类受体特异性的蛋白,其中包括APO2L/TRAIL(DR4和DR5),FasL(Fas/APO1/CD95)以及TNF(TNF-R1)。这些配体的结合能够导致三聚体的产生,从而募集一些因子形成受体的集群以增强凋亡的应答,与Fas相关的死亡结构域蛋白(FADD)和起始因子Caspase-8以及10能够组合形成复合体,该复合体也被称为死亡诱导信号复合物(DISC)。这些凋亡起始因子由于其对于诱导凋亡作用的必要性而因此得名,同时,这些在DISC中彼此相邻的凋亡起始因子可以很方便地进行自我激活,这些激活物因此激活效应因子caspase-3,6和/或者7并进入内源性凋亡通路。(2)细胞内凋亡途经：由于该途经的凋亡起始于细胞内的线粒体,因此也被称为线粒体途经,当受到一些细胞内应激信号的刺激如DAN的损伤、缺氧、细胞周期的缺陷以及细胞存活因子的丢失后就会激活细胞内凋亡途经。这条通路的调节与细胞内促凋亡蛋白(caspase蛋白家族)和抑凋亡蛋白(Bcl-2蛋白超家族)的平衡状态关系密切。当内源性凋亡通路被细胞内的应激信号激活后导致促凋亡蛋白如BAD(细胞死亡的Bcl-2抑制剂)、BID(BH3作用区域的死亡激活剂)、BIM(Bcl-2作用的细胞死亡调节因子)、BMF(Bcl-2修饰因子)、PUMA(P53上调的凋亡调节因子)以及Noxa的上调。然后这些蛋白与抗凋亡蛋白家族成员结合从而抑制他们的作用。Bcl-2家族成员含有一个或者多个BH结构域,其中BH3结构域的一个亚群包括BID和BIM能够结合并抑制抗凋亡蛋白的作用,但是同时也能激活效应蛋白BAK和BAX。其它蛋白都被称为“增敏剂”,其中包括BAD、HrK、Noxa和PUMA[11]。这些蛋白与Bcl-2蛋白的疏水槽结合后从而阻止抗凋亡蛋和促凋亡蛋白的相互作用。一旦通路被激活后,BAK和BAX立即同源寡聚体化并在OMM上形成小孔,从而导致外膜渗透化作用增加。最终导致细胞色素C和Smac/DIABLO的释放到细胞质中。细胞色素C与APAF-1和caspase-9蛋白前体形成复合物,从而激活caspase-9,随后激活caspase-3从而导致凋亡的发生。(3)其它途经如内质网凋亡途经：内质网是细胞内蛋白质合成、翻译后修饰、折叠的主要场所,同时也是钙储备和钙信号转导的主要部位。当受到细胞内外因素的刺激如感染、缺血和组织缺氧等都可能导致内质网钙离子通道的改变,使细胞内钙平衡失调,Ca2+是真核细胞内重要的信号转导因子,它的动态平衡在细胞正常生理活动中起着很重要的作用。大量的研究表明,细胞内钙失调是诱导细胞凋亡发生的重要机制之一。他们发现,高浓度的Ca2+可以激活胞质中的钙依赖性蛋白酶,同时又可以作用于线粒体,影响其通透性和膜电位的改变,从而促进凋亡。目前,As203对于急性髓细胞白血病(acutemyeloidleukemia,AML)的治疗效果己被得到肯定,通过与其它化疗药联用使得本病的完全缓解率有了显著的提升,然而,仍有相当一部分患者并不能达到完本缓解或是缓解后在短期内遭遇复发的痛苦,因此,寻找一种增加As203的化疗效果同时降低其副作用的治疗措施就成为了当前研究热点之一,我们的研究结果提示,阿克拉霉素(aclacinomycin,ACM)与As203联用后,能显著抑制人类急性髓细胞白血病细胞株KG-1a细胞的增殖并诱导凋亡。ACM是一种有效的蒽环类肿瘤化疗药物,有研究报道ACM主要是由于它作为拓扑异构酶I和II的抑制剂从而发挥其抗肿瘤作用。目前临床利用ACM联合阿糖胞苷治疗AML也取得一定的疗效,然而关于ACM诱导AML细胞凋亡的分子机理研究不多,此外,由于大剂量ACM化疗会产生严重的毒副作用,因此,限制了其临床应用。国内有学者通过ACM联合高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)处理AML细胞发现ACM和HHT联合后能协同杀伤AML细胞。为了探究联合药物对AML细胞的协同杀伤作用,我们在既往研究成果的基础上,以As203联合ACM作为研究对象,通过其对KG-1a细胞的作用,从其低毒和高效两个层次研究二者联合后对KG-1a细胞的杀伤作用及其分子机制,为临床AML的治疗提供科学实验依据。临床药物的研究离不开动物试验,我们知道,肿瘤是一种最常见的致死性疾病,每年大约有140万人患各种不同的肿瘤性疾病。所有的脊椎生物都有发生肿瘤的可能,通过利用脊椎动物作为模式生物,对于了解人类肿瘤发生和进展以及药物的研发都具有非常重要的意义。此外,脊椎动物果蝇和蠕虫已经被用于研究与癌症相关的遗传学机制,比如调控组织特异性以及和生长,细胞迁移,凋亡相关的机制。斑马鱼作为一种模式生物系统,具有脊椎动物模型和哺乳动物模型双重优势,产卵数量多和相对透明能帮助我们更好地鉴定涉及器官发育和造血发生的分子遗传学通路。最近,斑马鱼作为一种模式生物已被广泛用于肿瘤发生和易感性研究。鉴于斑马鱼在肿瘤研究模型上的独特优势,本课题的另一项研究就是以斑马鱼胚胎为研究模型,以人急性髓细胞白血病细胞株KG-1a细胞为主要实验对象,研究斑马鱼白血病的异种异体移植模型建立的可行性,以便为我们研究急性白血病的体内发生,发展和转移等行为以及药物的研究提供理论基础。本研究分为两部分进行。第一部分：研究三氧化二砷联合阿克拉霉素对人类急性髓系白血病细胞的协同致死作用。第二部分：研究斑马鱼白血病异种移植模型建立的可行性。第一部分：三氧化二砷联合阿克拉霉素对人类急性髓系白血病细胞的协同致死作用目的：以人急性髓细胞白血病细胞株KG-1a细胞为主要实验对象,通过体外实验,研究As203联合ACM的协同致死作用,并探讨其相关的作用机制,为白血病的临床治疗提供新的思路。方法：采用CCK-8法和克隆形成实验检测不同浓度的As203和ACM对KG-la细胞增殖的影响,compusyn软件分析两药联合是否具有协同作用,瑞氏染色法和流式细胞术分析As203和ACM单药或联合作用对KG-1a细胞周期的阻滞及诱导凋亡作用,同时采用蛋白质芯片技术分析联合药物作用后多种凋亡相关蛋白的表达情况；利用免疫印迹法观察As203和ACM单药或联合作用对凋亡相关蛋白的表达的差异,探讨联合药物协同细胞毒效应的分子机制。结果：本课题首次利用三氧化二砷联合阿克拉霉素A来研究这种联合药物作用对人类急性髓系白血病细胞的协同细胞毒作用,CCK-8结果显示,As203和ACM单药对KG-1a细胞具有生长抑制作用,且呈时间和剂量依赖性增加。Compsyn软件分析表明,0.4μM,1.5uM和3.0μM的AS203和10nM,37.5nM,75nM的ACM以40：1进行固定联合后,所有联合药物组的CI值都小于1,表明两药联合具有协同作用。进一步研究表明,A8203对KG-la细胞的毒性作用主要表现为诱导凋亡和细胞周期阻滞。我们发现,As203在0.4μM,1.5μM和3.0μM的浓度下作用48小时后,KG-1a细胞的总凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)分别为7.6±0.71%,19.1±3.38%和29.5±2.42%。10nM,37.5nM,75nM的ACM作用48小时后总凋亡率分别为18.7±1.68%,26.7±1.87%和28.6±2.76%,对照组为3.1±0.95%。而两药联合作用的调亡率达到34.5±2.48%,52.5±5.36%和61.3±4.87%。细胞周期方面：As203在0.4μM,1.5μM和3.0μM的浓度下作用48小时后,KG-1a细胞的G0/G1期细胞比例分别为64.32±0.55%,53.04±4.28%和47.13±6.19%；S期细胞比例分别为29.07±5.66%,40.13±1.83%,43.13±2.06%；G2/M期细胞比例分别为6.61±0.7%,6.83±0.98%,9.74±1.8%；对照组G0/G1期,S期和G2/M期细胞比例分别为69.59±1.72%,26.02±0.34%,4.39±0.4%.这些结果表明As203显著使KG-1a细胞周期阻滞于S期,而G0/G1期的细胞比例显著下降.同样的检测方法,10nM,37.5nM,75nM的ACM作用48小时后,KG-1a细胞的G0/G1期细胞比例分别为60.15±1.89%,55.19%±1.63和53.08±1.69%；S期细胞比例分别为34.98±1.47%,34.78±0.45%,34.37-4.15%；G2/M期细胞比例分别为4.86±0.1%,10.03±1.7%,12.54±2.41%.结果表明ACM主要是使KG-1a细胞阻滞在G2/M期.而两药联合组细胞周期的分布分别为G0/G1期43.21±1.36%,35.861.33%,35.83±2.98%；S期47.77±2.77%,54.45±5.5%,58.44±1.38%；G2/M期9.02±0.77%,9.71±1.12%,5.72±1.01%.该结果表明联合药物处组与对照组和单药处理相比S期阻滞更为显著。为探索联合药物协同致死的可能机制,我们还利用蛋白芯片技术分析了联合药物处理后多种凋亡相关蛋白的表达。蛋白芯片结果显示,联合药物作用后,多种促凋亡蛋白的表达上调,同时抗凋亡蛋白下凋,非常有意思的是,我们发现As203联合ACM处理组抗凋亡蛋白survivin的表达水平明显高于对照组单药处理组,然而另一种抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平却显著下凋,我们推测这是由于As203和ACM联合抑制BCL-2表达后导致的survivin蛋白补偿性表达增加从而逃避协同致死一种表现。为了进一步探究As203联合ACM对KG-la细胞协同致死的分子机制,我们还利用克隆形成实验,瑞氏染色和Westernblot技术对联合药物的作用的抑制增殖、促凋亡机制进行了检测。克隆形成实验结果显示,联合药物处理组与对照组和单药处理组相比,具有显著的抑制细胞增殖,同时瑞氏染色实验表明联合药物处理组与单药处理组相比,在凋亡形态学上的变化更为显著。Westernblot结果也显示联合药物处理后,caspase-3促凋亡蛋白显著被激活同时抗凋亡蛋白Bcl-2与单药和对照组相比显著下调。结论：As2O3和ACM在一定的浓度下对急性髓系白血病细胞KG-1a细胞具有增殖抑制作用,且该作用呈时间和剂量依赖性增加。As2O3联合ACM后与单药相比对KG-1a细胞具有更为显著的凋亡诱导以及细胞周期阻滞作用,并且研究发现所有联合处理组的联合指数(CI)都明显小于1,表明两药联合后确实具有协同致死作用。As2O3联合ACM可能通过协同激活caspase信号通路而抑制AML细胞增殖并诱导凋亡。第二部分：斑马鱼白血病异种移植模型建立目的：以斑马鱼胚胎作为实验模型,探寻斑马鱼白血病异种异体移植模型建立的可行性,从而为白血病的研究提供一种更为直接的体外研究模型。方法：利用MitoRed染料对KG-1a细胞进行染色,并通过细胞毒性和荧光显微镜分析MitoRed的最佳染色浓度和最佳荧光强度。采用显微注射法进行KG-1a细胞的移植并利用荧光显微镜对移植后的斑马鱼进行筛选,并观察移植后斑马鱼胚胎的大体存活状态、细胞在斑马鱼体内的增殖和扩散转移,组织学切片观察移植后细胞对斑马鱼组织器官侵袭作用。结果：本实验第二部分主要研究斑马鱼白血病细胞异种移植模型建立的可行性。结果显示(1)高浓度的MitoRed对KG1a细胞的增殖有一定的影响,低浓度的MitoRed(200nM-500nM)对KG1a的增殖无影响(P>0.05),终浓度500nmol/L作用30min为MitoRed标记KG1a细胞的最理想条件,此条件标记的KGla细胞荧光强度最佳,并且能示踪到第7天不淬灭；(2)KG1a细胞移植入斑马鱼胚胎的卵黄囊后,通过荧光显微镜观察到荧光细胞数目增加并逐渐扩散至整个腹腔,体外计数结果也显示植入细胞明显增殖,表明植入细胞能够在斑马鱼体内存活,增殖并扩散；(3)实验组斑马鱼7d存活数相比于对照组明显下降(p<0.05)(4)组织学切片检测可见植入细胞侵袭斑马鱼肝组织结论：异种移植的人急性髓系白血病细胞KG1a可以在斑马鱼体内存活,增殖和扩散,并侵袭斑马鱼组织器官,提示利用人类白血病细胞在斑马鱼体内建立异种移植模型是可行的。
【作者】叶永斌；
【导师】郭坤元；
【作者基本信息】南方医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】三氧化二砷；阿克拉霉素A；急性髓系白血病；斑马鱼；急性髓系白血病细胞；异种移植；

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