利用CRISPR/Cas9进行基因编辑

【摘要】CRISPR/Cas系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统,通过RNA介导,特异性的切割外源遗传物质,用以对抗入侵的病毒和质粒。利用Cas9来摧毁入侵DNA的TypeⅡCRISPR/Cas系统,被证明可以在试管中高效切割任一给定的DNA。我们通过密码子优化,合成Cas9基因,通过注射Cas9mRNA和chiRNA到斑马鱼受精卵,发现Cas9可以在斑马鱼受精卵中切割真核基因。在Cas9N端加上NLS-flag-linker,可以更好的让Cas9进入细胞核。通过注射NLS-flag-linkerCas9mRNA和chiRNA到小鼠—细胞其受精卵,我们成功得到首只基因修饰小鼠,证明了CRISPR/Cas9可以应用于小鼠的基因操作。然后利用CRISPR/Cas9的多能性,通过同时注射Cas9mRNA和多个sgRNA,我们得到多基因修饰的小鼠和大鼠。受到这些成功的鼓励,我们扩展了CRISPR/Cas9的使用范围,通过在食蟹猴—细胞期受精卵中注射Cas9mRNA和sgRNA,我们成功得到两只含有Ppra-γ和RagI突变的食蟹猴。在随后的研究中,我们发现在小鼠体内,CRISPR/Cas9会存在脱靶效应,并且脱靶位点的突变也可以遗传到后代。为了提高CRISPR/Cas9的特异性,我们尝试使用Cas9切口酶和一对sgRNA,两个相近的切口可以组成DNA双链断裂,诱导细胞发生非同源末端连接修复,引入突变,而在脱靶位点几乎只会形成一个切口,但是基因组上的切口可以通过碱基切除修复方式完美修复。通过转染细胞的γ-H2AX染色,我们发现这种策略(Cas9切口酶/sgRNA对)可以降低对基因组的损伤。在小鼠上,这种策略可以高效突变目的基因,但是检测不到已知的脱靶位点。在Hela细胞上,我们检测24个已知脱靶位点,通过T7EN和深度测序分析,Cas9切口酶/sgRNA对确实可以大大降低脱靶效应。通过系列成对sgRNA的切割实验,我们发现相间10-30bp、尾对尾方式排列的成对sgRNA具有高效的切割活性。利用这种策略,我们在小鼠体内可以同时敲除多个基因,并且可以进行大片段敲除。在细胞和小鼠上,我们都证明了Cas9切口酶/sgRNA对可以降低脱靶效应,并且不影响靶位点突变效率,这种方法可以广泛应用到其他物种的基因打靶。
【作者】沈彬；
【导师】黄行许；
【作者基本信息】南京大学，生物学，2014，博士
【关键词】CRISPR；Cas9；切口酶；基因打靶；脱靶效应；小鼠；大鼠；食蟹猴；

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