胶质细胞间缝隙连接在神经病理性疼痛中的作用机制

【摘要】[目的]在外周神经损伤后,位于脊髓背角的感觉神经元兴奋性增强,成为传递和调控痛觉的重要位点。而背角神经元周围的星形胶质细胞在神经元兴奋性增强,痛觉敏感传递,尤其是神经病理性疼痛的维持中也起到重要作用。虽然已知星形胶质细胞之间信号传递的一个重要途径是缝隙连接,但脊髓胶质细胞间缝隙连接在维持神经病理性疼痛中的作用并不清楚,尤其是特异性表达在星形胶质细胞之间的缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)在神经病理性疼痛中的作用。甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)是非特异性缝隙连接阻滞剂,可非特异性阻滞缝隙连接的功能。利用小干扰RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)技术可以特异性降低星形胶质细胞间缝隙连接蛋白Cx43的表达。本研究旨在观察用药物(如甘珀酸)阻滞缝隙连接功能和siRNA下调脊髓Cx43蛋白表达能否抑制神经病理性疼痛或降低脊髓背角广动力范围神经元的活性。[材料与方法]1.建立大鼠脊神经结扎(Spinalnerveligation,SNL)神经病理性疼痛模型后,使用甘珀酸(CBX)鞘内注射。首先在大鼠持续异氟烷吸入麻醉下,单次注射不同剂量的CBX,采用清醒动物行为学观察大鼠机械痛敏和热痛敏的变化。其次,进一步观察和对比相同剂量的CBX、甘草酸(Glycyrrhizicacid,GCA,是CBX的类似物,但不阻滞缝隙连接)、甲氟喹(Mefloquine,MFQ,是特异性神经元缝隙连接阻滞剂)对大鼠机械痛敏的不同影响。最后,检测连续注射CBX对大鼠机械痛敏是否有长期影响。2.建立大鼠SNL神经病理性疼痛模型后,动物在麻醉状态下在体记录脊髓背角广动力范围(Widedynamicrange,WDR)神经元的活性,并观察记录脊髓表面给予CBX药物处理后,WDR神经元对外周机械性刺激反应的变化。此外,在WDR神经元上记录反复电刺激外周感受野所诱发的C纤维传导的动作电位增强的变化,并做出windup曲线。观察脊髓表面应用CBX对WDR神经元C-componer动作电位windup的影响。3.免疫荧光方法检测和比较假手术组与SNL组腰段脊髓胶质纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprotein,GFAP,星形胶质细胞标志)、Cx43和OX42(小胶质细胞标志)蛋白的表达分布。4.构建Cx43siRNA和ControlsiRNA,将大鼠分为假手术组、Cx43siRNA组和ControlsiRNA组。观察鞘内反复注射siRN垢,SNL大鼠机械痛敏的变化。同时采用Westernblot检测双侧SNL大鼠腰段脊髓Cx43,Cx36,和GFAP蛋白表达水平的变化。[结果]1.在大鼠SNL术后2-3周,鞘内注射CBX(0.1μig、0.5μg、5μg、25μg、50μg,10μl注射量)可剂量依赖性地抑制SNL诱导的机械痛敏。鞘内注射CBX5μg也明显抑制了大鼠热痛敏。与对照组相比,在相同剂量(0.81nmol、8.1nmol、81nmol)下,CBX明显抑制了大鼠机械痛敏,而GCA和MFQ无明显镇痛作用。虽然GCA在最大剂量81nmol下似乎对机械痛敏有抑制作用,但大鼠表现出明显药物副作用。连续注射CBX(25μg/天,连续3天)过程中,对大鼠机械痛敏的抑制作用表现出了明显的累加效应,即在第2天和第3天给药前所测得的机械缩足阈值均明显比第1天给药前高。2.脊髓表面应用CBX可以明显减少SNL大鼠WDR神经元对递增机械刺激的反应,并明显抑制WDR神经元所表现的对电刺激诱导C-component的windup现象。3.与假手术组相比,免疫荧光实验显示大鼠腰段脊髓背角星形胶质细胞(GFAP)和小胶质细胞(OX42)在SNL后均明显激活；脊髓背角Cx43表达在SNL后明显减少。星形胶质细胞标志GFAP与Cx43的表达有共同定位,而小胶质细胞标志OX42与Cx43无明显共同定位。4.在大鼠SNL术后14-17天,鞘内注射Cx43siRNA明显抑制了SNL诱导的大鼠机械痛敏,并下调了腰段脊髓Cx43的表达,而对GFAP表达无明显影响。[结论]1.鞘内注射CBX可以剂量依赖性的抑制SNL诱导的机械性痛敏,其机制可能通过抑制胶质细胞间的缝隙连接功能。2.脊髓表面应用CBX可以抑制WDR神经元对递增机械刺激的反应,也可以减少电刺激诱导WDR神经元C-component的windup,表明CBX对机械性痛敏的抑制作用可能由于其对脊髓WDR神经元兴奋性的抑制作用。3.神经损伤后,位于脊髓的星形胶质细胞和小胶质细胞均被激活,但Cx43表达下降。而SNL术后14-17天,采用鞘内注射Cx43siRN进一步下调Cx43表达后,机械性痛敏明显减轻。这些结果表明神经损伤后,虽然Cx43蛋白表达量减少,但缝隙连接的功能或通透性可能增强了。4.综上所述,本研究发现脊髓胶质细胞之间缝隙连接的功能增强,尤其是Cx43所构成的缝隙连接,可能在维持SNL诱导的神经病理性疼痛中起到重要作用。这些新发现为神经病理性疼痛的机制研究提供了新线索,也为临床治疗神经病理性疼痛提供了重要靶点。
【作者】许倩；
【导师】李金恒；李伟彦；
【作者基本信息】南京大学，内科学，2014，博士
【关键词】神经病理性疼痛；胶质细胞；缝隙连接；connexin43；

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