RIP_1K通过激活自噬—溶酶体途径介导缺血性脑中风神经元necroptosis

【摘要】目的：本实验室前期工作发现RIP1K特异性抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)及RIP1K基因沉默均可显著减少大鼠及小鼠永久性大脑中动脉阻塞(permanentmiddlecerebralarteryocclusion,pMCAO)诱导的脑梗塞体积，明显改善神经症状。本文进一步探讨RIP1K是否通过激活自噬-溶酶体信号途径参与缺血性脑中风诱导的神经元necroptosis。方法：在体内，通过采用大、小鼠永久性大脑中动脉阻塞(permanentmiddlecerebralarteryocclusion,pMCAO)的方法，建立缺血性脑中风模型。透射电镜法观察缺血性脑中风诱导的神经元的形态学变化；侧脑室注射Nec-1及慢病毒观察对pMCAO处理的缺血皮层的影响。在体外，采用对原代大鼠皮层神经元氧糖剥夺（oxygen-glucosedeprivation,OGD)的方法，建立缺氧缺糖细胞模型。光镜法观察OGD诱导的神经元细胞形态学变化；LDH法检测OGD诱导的神经元乳酸脱氢酶漏出率；慢病毒转染法对培养第五天的神经元进行RIP1K基因沉默。Westernblot法检测体内、体外缺血缺氧处理后的神经元RIP1K介导的自噬-溶酶体信号通路相关蛋白的表达，以及给予Nec-1或RIP1K基因沉默后对此通路相关蛋白表达的影响。结果：透射电镜显示：pMCAO处理12h后，小鼠皮层神经元呈坏死样形态，给予Nec-1后，皮层神经元细胞坏死形态明显好转。在OGD诱导的神经元缺氧缺糖的细胞模型中，光镜结果显示：OGD处理后神经元坏死数显著增加，给予Nec-1(1,10,100μM)后可明显的改善细胞形态，增加细胞数目。LDH结果显示：OGD处理后，LDH漏出率显著增加(P<0.01)，Nec-1(1,10,100μM)可显著的降低神经元乳酸脱氢酶漏出率(P<0.05，P<0.01)。Westernblot结果显示：在体内、体外，缺血性神经元中RIP1K蛋白表达量增加(P<0.01)，MAP2蛋白表达量下降(P<0.01)。给予Nec-1及RIP1K基因沉默之后，均可显著的下调RIP1K蛋白的表达(P<0.01)，上调MAP2蛋白的表达(P<0.01)。Westernblot结果亦显示：在OGD诱导的神经元中，自噬-溶酶体通路相关蛋白LC3、CathepsinB、CathepsinL表达量上调(P<0.01)，Nec-1及RIP1K基因沉默均可下调OGD诱导的神经元中LC3、CathepsinB、CathepsinL蛋白的表达(P<0.05，P<0.01)。结论：1.Nec-1及RIP1K基因沉默对pMCAO和OGD诱导的神经元损伤均具有显著的保护作用。2.Nec-1及RIP1K基因沉默对缺血性脑中风诱导的神经元necroptosis的保护作用与抑制RIP1K激活的自噬-溶酶体信号通路有关。
【作者】荣加国；
【导师】张慧灵；
【作者基本信息】苏州大学，药理学，2014，硕士
【关键词】RIP1K；necroptosis；神经元；Nec-1；自噬；Cathepsins；pMCAO；OGD；

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