NMDA受体活化Ca~(2+)信号传导通路RBMECs高表达P-gp中的机制初探

【摘要】第一部分谷氨酸诱导RBMECs高表达P-gp模型的建立及NMDA受体抑制剂对P-gP表达影响的观察目的：建立谷氨酸诱导RBMECs高表达P-gp的模型,了解NMDA受体抑制剂在该模型中对P-gp表达的影响。方法：选取新生1-2天Wistar大鼠,断头取脑,去除脑膜、大血管以及纤维结缔组织以及神经元细胞,保留微血管内皮细胞,以高糖DMEM+bFGF培养液培养10天至铺满培养皿,给予一定浓度的谷氨酸作用,MTT法测定细胞活力,并确定合适的谷氨酸浓度,分为MK801+Glu组,Glu+PBS组以及Control对照组,以RT-qPCR检测各组Mdrla、Mdrlb、Mrp2mRNA转录水平,WesternBlot法检钡P-gp、MRP2表达水平。结果：本部分研究发现100μmol/L谷氨酸作用使得RBMECs细胞活力>95%。Glu+PBS组Mdrla、MdrlbmRNA在1h、3h、6h时间点表达水平高于对照组,P-gp在3h、6h、24h、72h时间点表达水平显著高于对照组。MK801+Glu组Mdrla、Mdrlb表达水平在3h时间点时明显低于Glu+PBS组,P-gp24h时间点表达水平明显低于Glu+PBS组。结论：100μmol/L谷氨酸刺激RBMECs使得Mdrla、MdrlbmRNA转录水平升高。本部分研究成功制备了谷氨酸刺激RBMECs高表达P-gp的细胞模型。NMDA受体抑制剂MK801可以显著降低谷氨酸RBMECsMdrla、MdrlbmRNA转录水平以及P-gp表达水平。第二部分谷氨酸诱导NMDA受体活化信号通路中关键调控因子的活化检测目的：检测谷氨酸信号传导通路关键调控因子及其下游转录或延长因子的活化程度,进一步研究耐药调控机制,并选取合适的实验干预位点。方法：选取新生1-2天Wistar大鼠,保留脑微血管内皮细胞,并以高糖DMEM+bFGF培养液培养10天至铺满培养皿,分为MK801+Glu组、Glu+PBS组以及Control对照组,以WesternBlot法检测eEF-2K表达水平、eEF-2表达水平以及磷酸化水平、NF-κB表达水平,ELISA法检测NF-κB(p65)活化程度。结果：Glu+PBS组6h、24h、72heEF-2K表达水平明显高于对照组,Glu+PBS组5min、1heEF-2磷酸化水平明显高于对照组。MK801+Glu组6h、24h、72h时间点eEF-2K表达水平均低于Glu+PBS组,5min、1h、3heEF-2磷酸化水平亦低于Glu+PBS组,并与P-gp表达水平相一致。Glu+PBS组1h、3h时间点NF-κB(p65)活化水平较对照组明显增高,Glu+PBS组在1h、3h、6h、24h时间点Mdrla转录水平较对照组明显增高。MK801+Glu组1h、3h时间点NF-κB(p65)活化水平仅略低于Glu+PBS组,而6h、24h时间点NF-κB表达水平略高于Glu+PBS组。结论：谷氨酸NMDA受体活化引起eEF-2K蛋白表达水平升高、eEF-2磷酸化水平的升高以及P-gp高表达,提示NMDA受体活化后可能通过Ca2+-CaM-eEF-2K-eEF-2信号通路参与P-gp表达调控。NMDA受体抑制剂MK801抑制NMDA受体活化所引起的eEF-2K高表达、eEF-2高磷酸化水平以及P-gp高表达,提示对NMDA受体进行干预可能通过下游激酶eEF-2K及延长因子eEF-2参与对P-gp的表达调控。谷氨酸NMDA受体活化增加NF-κB活化水平,提示NF-κB的活化可能参与NMDA受体激活引起的P-gp表达增高。MK801未明显影响NF-κB活化水平增高,提示NMDA受体抑制剂可能无法终止NF-κB的活化。第三部分eEF-2K干预剂对谷氨酸诱导RBMECs高表达P-gp的调控作用及其机制研究目的：通过对eEF-2K进行干预以了解eEF-2K抑制剂对谷氨酸刺激RBMECs细胞模型P-gp表达水平的影响。观察eEF-2K抑制剂NH125对下游eEF-2的表达水平、磷酸化水平及P-gp表达水平的影响；了解应用MK801、NH125对信号通路上下游同时进行阻断对P-gp表达水平的影响。方法：选取新生1-2天Wistar大鼠,保留脑微血管内皮细胞,并以高糖DMEM+bFGF培养液培养10天至铺满培养皿,MTT方法检测eEF-2K抑制剂NH125各浓度作用下细胞活力,确定NH125合适的浓度,并分为NH125+Glu组、Glu+PBS组、NH125+PBS组、NH125+MK801+Glu组、MK801+Glu组以及Control对照组,以RT-qPCR法检测Mdr1a、Mdr1bmRNA转录水平,WesternBlot法检测eEF-2表达水平、磷酸化水平及P-gp表达水平。结果：1μmol/LNH125+Glu组1h、3h、6h时间点Mdr1a、Mdr1bmRNA相对表达量略低于Glu+PBS组。NH125+Glu组3h、6h时间点P-gp表达略低于Glu+PBS组,24h时间点P-gp表达明显低于NH125+PBS组。NH125+Glu组eEF-2表达水平与Glu+PBS组无显著差异。NH125+Glu组在5min、1h时间点phospho-eEF-2表达明显低于Glu+PBS组(P<O.05),3h时间点phospho-eEF-2表达略低于Glu+PBS组。NH125干预后6h、24h时间点P-gp表达显著低于MK801+glu组,3h时间点P-舒表达水平略低于MK801+glu组。NH125+MK801+Glu组5min、1h、3heEF-2磷酸化水平较MK801+GlU明显降低。结论：NH1251μmol/L作为eEF-2K抑制剂可应用于谷氨酸刺激RBMECs高表达P-gp细胞模型的研究。NH125能显著降低谷氨酸刺激RBMECs细胞模型中P-gp表达水平。NH125作为eEF-2K的抑制剂能显著降低eEF-2磷酸化水平,可能在肽链延长阶段对P-gp表达进行调控。NH125联合MK801干预可能通过降低eEF-2磷酸化水平,较完全抑制谷氨酸刺激RBMECs高表达P-gp的效应。结论1.创建了谷氨酸RBMECs诱导P-gp高表达的体外模型。2.谷氨酸NMDA受体活化引起eEF-2K蛋白表达水平升高、eEF-2磷酸化水平的升高以及P-gp高表达,提示NMDA受体活化后可能通过Ca2+-CaM-eEF-2K-eEF-2信号通路参与P-gp表达调控。3.NMDA受体抑制剂MK801可以抑制NMDA受体活化所引起的eEF-2K高表达、eEF-2高磷酸化水平以及P-gp高表达,提示对NMDA受体进行干预可能引起相应信号通路的关键激酶以及延长因子,达到对P-gp表达的调控。4.谷氨酸NMDA受体活化增加NF-κB活化水平,给予NMDA受体抑制剂MK801未明显影响NMDA受体活化所引起的NF-κB活化水平增高,提示NMDA受体抑制剂可能无法终止NF-κB的活化。5.NH125能显著降低谷氨酸刺激RBMECsP-gp高表达模型中P-gp的表达水平。6.NH125作为eEF-2K的抑制剂能显著降低eEF-2磷酸化水平,而不影响eEF-2磷酸化水平,进而可能对P-gp表达进行调控。7.NH125联合MK801作用于NMDA受体活化Ca2-信号通路的不同靶位,通过降低eEF-2磷酸化水平,抑制P-gp高表达效应。
【作者】唐兴华；
【导师】洪震；
【作者基本信息】复旦大学，神经病学，2013，博士
【关键词】癫痫；P-gp；RBMEC；NMDA受体；MK801；eEF-2K；eEF-2；NF-κB；NH125；

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