纳米细菌致胎盘钙化机理的初步探讨

【摘要】第一部分纳米细菌的分离、培养、形态观察和相关蛋白表达背景：自从Kajander等在牛血清中发现了纳米细菌抗原以来，纳米细菌一直作为结石和钙化疾病的危险因素。近年来研究发现纳米细菌与结石、炎症、动脉硬化等很多疾病密切相关。有学者在人类唾液、牙齿表面、牙菌斑、牙结石和牙髓石、肾结石、胆结石、膀胱结石、尿结石和前列腺结石、慢性前列腺炎、动脉粥样硬化斑块中分离培养出纳米细菌。而且从文献报道可以得知，纳米细菌并没有组织特异性，分别从组织、血液、唾液、关节腔积液中分离培养出了纳米细菌。然而胎盘钙化（placentalcalcification，PC）是否与纳米细菌相关，未见报道。胎盘钙化好发于妊娠后期，是产科最常见的病理钙化改变，严重的Ⅲ级钙化会导致胎儿功能不全时，发生胎儿窘迫、胎儿生长受限、胎儿畸形、吸入性肺炎、新生儿窒息等一系列妊娠并发症，其机制不明确。而胎盘钙化与纳米细菌是否相关，未见报道，本文旨在研究纳米细菌与胎盘钙化的关系和作用机理。目的：1.寻找纳米细菌和胎盘钙化相关的直接依据。2.各种组织中培养分离的纳米细菌与胎盘钙化组织中培养的纳米细菌的形态学比较和阳性率比较。3.探讨纳米细菌快速增殖的方法。4.探讨钙化相关蛋白OPN，BMP-2、凋亡相关蛋白（Bax、Fas）和致炎因子（IL-6）与纳米细菌和胎盘钙化的关系。方法：1.取新鲜钙化的胎盘组织直接切片、染色，透射电镜下观察纳米细菌，同一胎盘的正常组织为阴性对照。2.钙化胎盘和同一孕妇的脐血的纳米细菌分离培养的阳性率比较和形态学比较。3.不同孕妇的钙化胎盘和正常胎盘组织的纳米细菌分离培养的阳性率比较和形态学比较。4.从钙化胎盘中培养的纳米细菌与从胆结石中培养的纳米细菌的形态学比较。5.采用不同的增殖方法进行纳米细菌培养，观察其浊度值变化。6.分别采用WB和免疫组化方法测定了钙化胎盘组（NB+）和非钙化胎盘组（NB-）中OPN、BMP-2、Bax、Fas的表达。7.采用ELISA方法测定了钙化胎盘和非钙化胎盘静脉血和脐血中的IL-6浓度；8.采用全自动生化分析仪测定了两组静脉血和脐血中的ALP的浓度。结果：1.采用直接切片在透射电镜下从钙化胎盘组织中找到形态与文献报道的相似的纳米细菌，为圆形或椭圆形纳米颗粒，直径约为50-500nm，每个颗粒都被具有不同电子密度的薄外壳包裹，有毛刺；而正常胎盘组织中没有发现类似纳米颗粒。2.分离培养了20份钙化的胎盘组织及其脐血中的纳米细菌，为白色沉淀完全或部分粘附在试管底部，其阳性率分别为65%和80%，二者没有统计学差异（p>0.05），二者的形态相似。3.分离20份正常胎盘组织中和其脐血中的纳米细菌，其阳性率分别为10%和20%，与钙化组比较，显著低于钙化组（P<0.01）,但形态没有差别。4.分离培养了20例胆结石中的纳米细菌，同样为白色沉淀，其致密度强于胎盘组织分离培养的纳米细菌，阳性率为90%，高于钙化胎盘组织，其透射电镜下形态与钙化胎盘组织中的纳米细菌相似。5.分瓶传代的方法，纳米细菌增殖的速度高于直接换液的方法，平均6-10天，浊度值增加1倍。6.钙化组中的OPN、BMP-2、Bax、Fas、和ALP都显著高于非钙化组（p<0.01）。结论：纳米细菌与胎盘钙化具有明显的相关性，且其形态与文献报道一致。另外纳米细菌的感染没有组织特异性，从胎盘组织、脐血和结石中培养出来的纳米细菌形态相似；脐血中培养的纳米细菌和钙化胎盘组织中培养的纳米细菌可能具有同源性。分瓶传代有助于纳米细菌的增殖。纳米细菌、细胞凋亡、致炎因子和ALP都可能参与胎盘钙化的形成，纳米细菌可能是其中一个诱导因素。第二部分纳米细菌和羟基磷灰石对各种细胞的细胞毒作用及其机理的初步探讨背景：前面已从组织层面证明了纳米细菌和钙化胎盘组织相关，而且可使钙化胎盘的凋亡相关蛋白和致炎因子上调。有文献报道纳米细菌可抑制成纤维细胞的增殖。纳米羟基磷灰石可致肿瘤细胞凋亡，与正常的成纤维细胞和成骨细胞却具有很好的相容性。那么纳米细菌可否使正常的成骨细胞和相关的肿瘤细胞发生细胞毒作用呢？通过比较纳米细菌和纳米羟基磷灰石对生长良好的成骨细胞C3H10、乳腺癌MDA-MB-231细胞和绒癌JAR细胞的细胞毒作用来从细胞层面探讨纳米细菌的致毒和致炎作用及其机理。目的：比较纳米细菌和纳米羟基磷灰石对各种细胞的细胞毒作用，进一步阐明引起这些细胞毒作用的机理及其与钙化相关蛋白、细胞凋亡相关蛋白的关系。方法：分别用纳米细菌和纳米羟基磷灰石作用生长良好的成骨细胞C3H10、乳腺癌MDA-MB-231细胞和绒癌JAR细胞。然后通过CCK8测定其细胞增殖抑制率；用hoechest22358荧光染色、流式细胞仪测定细胞的凋亡率；采用倒置显微镜和电子显微镜观察细胞的形态的改变；用Westernblot测定三种细胞中OPN、BMP-2、Bax、Fas蛋白表达。结果：倒置显微镜下观察，培养48h后乳腺癌MDA-MB-231细胞胞浆中可见吞噬了NB和HA，与对照组比较，细胞浆中出现大量的空泡，NB细菌的作用强于HA组。成骨细胞C3H10和绒癌JAR细胞在倒置显微镜下的形态变化不明显。CCK8结果表明：培养48h后NB和HA均能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞和绒癌JAR细胞增殖，NB作用强于HA，且具有时间和浓度依赖性。而对于成骨细胞C3H10，HA无细胞增殖抑制作用。Hoechest22358荧光染色、流式细胞仪测定显示，对于乳腺癌MDA-MB-231细胞和绒癌JAR细胞，NB和HA主要通过促进细胞凋亡发挥细胞毒作用，且NB作用强于HA。而对于成骨细胞C3H10HA无细胞毒作用。Westernblot测定发现，对于乳腺癌MDA-MB-231细胞和绒癌JAR细胞，OPN、BMP-2、Bax、Fas的表达，NB和HA均高于对照组，NB作用强于HA。而对于成骨细胞C3H10，HA组与对照组比较，钙化相关蛋白BMP-2高于对照组，凋亡相关蛋白Bax无明显变化；NB的BMP-2和Bax均高于对照组。透射电镜结果显示，NB可引起细胞凋亡，出现凋亡小体，线粒体肿胀，核固缩等细胞凋亡的特征；在JAR细胞中还可见细胞溶解和大量自噬体出现，而HA组和对照组没有明显的变化。结论：与对照组比较，纳米细菌和羟基磷灰石均能引起肿瘤细胞毒作用，无论是C3H10细胞还MDA-MB-231细胞及JAR细胞，纳米细菌的细胞毒作用均强于羟基磷灰石，主要通过促进细胞凋亡来发挥细胞毒作用。OPN、BMP-2、Bax、Fas的表达均强于HA，说明NB可促进OPN、BMP-2的表达，与钙化相关，而Bax、Fas升高预示NB可促进细胞凋亡，主要通过Fas和FasL的途径来发挥细胞毒作用。第三部分纳米细菌和羟基磷灰石致SD大鼠胎盘钙化的初步探讨背景：第一部分从组织层面证明了纳米细菌与胎盘钙化组织细胞凋亡相关；第二部分又从细胞层面对比了纳米细菌和纳米羟基磷灰石对人绒癌JAR细胞，人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人成骨细胞C3H10的细胞毒作用。NB不仅仅引起肿瘤细胞的凋亡，还可引起肿瘤细胞的死亡和正常人成骨细胞的凋亡和死亡，而HA仅仅只引起肿瘤细胞的凋亡，说明NB对细胞的细胞毒作用不仅仅是因为羟基磷灰石的作用，还与其分泌相关蛋白和增殖分裂相关。另外，纳米细菌和纳米羟基磷灰石均能上调钙化相关蛋白OPN和BMP-2。那么纳米细菌和纳米羟基磷灰石能不能直接引起胎盘钙化，我们拟通过SD大鼠造模来进行研究。目的：探讨纳米细菌是否可直接导致SD大鼠胎盘钙化，比较纳米细菌和羟基磷灰石对SD大鼠胎盘作用的差异。方法：取28只SD大鼠，7只雄，21只雌，按雌雄3:1合拢，在受孕10天，分PBS、HA、NB三组于宫角处注入200μl药物，于第14天加强一次，于受孕21天取出胎盘进行肉眼观察，电镜切片、组化染色、Westernblot测定及纳米细菌培养。结果：三组SD大鼠胎盘组织比较，肉眼未见明显钙化；纳米细菌培养均为阴性；透射电镜下观察组织切片，未见纳米颗粒和细胞形态学的改变；凋亡相关蛋白（Bax）和钙化相关蛋白（BMP-2）的表达无明显差异。结论：PBS、HA、NB三组SD大鼠的胎盘无明显钙化，形态结构和蛋白表达也无明显差异，一方面说明HA和NB作用大鼠胎盘时间较短，未形成钙化；另一方面说明NB只是引起细胞凋亡或死亡一个原因，与钙化相关，并不是引起胎盘钙化的直接原因。
【作者】张名均；
【导师】张德纯；
【作者基本信息】重庆医科大学，病原生物学，2014，博士
【关键词】纳米细菌；胎盘钙化；细胞凋亡；钙化相关蛋白；凋亡相关蛋白；纳米羟基磷灰石；C3H10；MDA-MB-231；JAR；动物模型；SD大鼠；

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