针对CXCR4融合多肽抗肿瘤研究

【摘要】恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的头号疾病，其中乳腺癌是威胁女性健康的第一位恶性肿瘤，而肺癌是威胁男性健康的第一位恶性肿瘤。随着分子时代的到来，针对肿瘤治疗的策略逐渐从“寻找和破坏肿瘤”向“靶向和控制肿瘤”转变，针对肿瘤的靶向分子治疗成为肿瘤防治的重点研究方向。肽类药物是靶向抗肿瘤药物的一个发展方向，具有低毒性与低组织蓄积性、高生物活性与高特异性等优点。选择特异性小肽类药物作用于肿瘤特异性调控因子、封闭其活性位点可用于治疗肿瘤。膜性CXC趋化因子受体4（chemokinereceptor4,CXCR4）及其配体间质衍生因子-1（stromal-derivedfactor-1,SDF-1,又称CXCL12）被公认为在调节多种实体肿瘤转移中起重要作用。本课题组的前期研究利用CXCR4作为靶向位点，设计了融合多肽TAT-DV3-BH3并进行了体内外抗肿瘤研究。结果表明TAT-DV3-BH3作为一个整体，可以保留发挥各组分肽段原有的功能。其中HIV-1反式激活因子（trans-activator,TAT）作为蛋白转导肽，能将TAT-DV3-BH3高效率转入细胞；人工合成的DV3作为多种肿瘤组织或肿瘤细胞高表达的CXCR4的靶向序列，赋予TAT-DV3-BH3靶向性和特异性；P53上调凋亡调控因子（P53up-regulatedmodulatorofapoptosis,PUMA）的唯一结构域BH3为效应段，使得TAT-DV3-BH3可诱导肿瘤细胞凋亡从而抑制肿瘤细胞和荷瘤裸鼠肿瘤生长。然而对于肿瘤防治，单纯靶向和抑制生长是远远不够的，肿瘤转移是影响肿瘤治疗和预后的关键性因素。因此，设计既能抑制肿瘤生长，又可抑制肿瘤迁移和侵袭的双功能融合多肽是本课题的研究方向。根据人工合成的DV1特异性结合和抑制CXCR4功能，本课题将①设计合成双功能融合多肽TAT-DV1-BH3，体外探讨其对肿瘤细胞生长、迁移和侵袭能力影响及其机制。②尝试用TAT-DV1作为高效靶向肿瘤的载体，合成融合多肽TAT-DV1-DEF，对本课题组前期研究得到的一条未知肽段DEF的抗肿瘤作用进行初步研究，并评价TAT-DV1作为高效靶向肿瘤的载体的可行性，为进一步研究抗肿瘤靶向多肽药物提供实验依据。第一部分针对CXCR4融合多肽抗乳腺癌实验研究目的：1．设计并合成双功能融合多肽TAT-DV1-BH3以及对照多肽TAT-DV1和DV1-BH3。2．验证融合多肽TAT-DV1-BH3对体外肿瘤细胞生长的靶向特异性；以及对人乳腺癌高转移细胞系MDA-MB-231和低转移细胞系MCF-7生长增殖的影响。3．验证融合多肽TAT-DV1-BH3对人乳腺癌高转移细胞系MDA-MB-231迁移和侵袭能力的影响。4．评价TAT-DV1的作为高效靶向载体的可行性。方法：1．采用CCK-8细胞毒实验筛选合适的实验用肿瘤细胞系，并分析融合多肽TAT-DV1-BH3对其生长的影响。2．激光共聚集显微镜观察融合多肽TAT-DV1-BH3在细胞中的分布。3．流式细胞术分析融合多肽TAT-DV1-BH3进入细胞的效率。4．DAPI染色后在荧光显微镜下观察融合多肽TAT-DV1-BH3处理细胞后细胞核形态的变化。5．用伤口愈合实验分析融合多肽TAT-DV1-BH3对人乳腺癌细胞系迁移能力的影响。6．采用Transwell实验分析融合多肽TAT-DV1-BH3对人乳腺癌细胞系侵袭能力的影响。7．Westernblot实验检测Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9，分析TAT-DV1-BH3诱导人乳腺癌细胞发生凋亡的信号通路。8．Westernblot实验分析TAT-DV1-BH3影响人乳腺癌细胞系迁移和侵袭能力的机制。结果：1．根据CCK-8细胞毒实验筛选出合适的实验用细胞系，分别是人胚肾细胞系HEK-293、人高转移乳腺癌细胞系MDA-MB-231、人低转移乳腺癌细胞系MCF-7。2．CCK-8细胞毒实验表明融合多肽TAT-DV1-BH3能特异抑制肿瘤细胞生长，对非肿瘤细胞HEK-293生长没有影响；TAT-DV1-BH3以剂量依赖方式抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7的生长；而对照多肽TAT-DV1和DV1-BH3对细胞生长无明显抑制作用。3．流式细胞术和激光共聚集显微镜均观察到融合多肽TAT-DV1-BH3和TAT-DV1转染后即快速(1h)高效（＞90%）进入细胞，分布在细胞质，主要与线粒体共定位；而不带TAT的肽段DV1-BH3进入细胞的效率很低（＜1.7%）。4．DAPI染色后荧光显微镜下观察到融合多肽TAT-DV1-BH3处理72h后人乳腺癌细胞系MDA-MB-231出现核膜破裂、核固缩等典型凋亡形态特征，Westernblot证实该作用是通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡实现的，与PUMA（BH3）诱导细胞凋亡的通路一致。5．伤口愈合实验和Transwell实验表明，融合多肽TAT-DV1-BH3能明显抑制高转移人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移和侵袭能力，Westernblot实验证实这种抑制作用是通过抑制CXCR4的功能，从而抑制PI3K和MMP-9的表达水平实现的。结论：本研究成功设计出双功能融合多肽TAT-DV1-BH3。体外实验发现，利用TAT-DV1作为高效靶向载体可将TAT-DV1-BH3快速高效带入细胞，并发挥DV1和BH3的功能。TAT-DV1-BH3通过线粒体途径，特异地剂量依赖性诱导人乳腺癌细胞发生凋亡从而抑制其生长。TAT-DV1-BH3通过DV1发挥抑制CXCR4的功能，抑制下游PI3K和MMP-9的表达水平，进而明显抑制人高转移乳腺癌细胞系MDA-MB-231迁移和侵袭能力。这些结果表明：双功能或多功能融合多肽抗肿瘤策略是可行的，为进一步探讨融合多肽抗肿瘤的研究及完善融合多肽设计提供了实验依据；提示TAT-DV1有可能作为肿瘤治疗的高效靶向载体，拓宽了融合多肽抗肿瘤设计思路。第二部分含DEF融合多肽抗肺癌实验研究目的：1．在前期研究基础上，尝试利用TAT-DV1作为高效靶向肿瘤载体进行未知肽段DEF的功能研究。2．进一步评价TAT-DV1作为肿瘤治疗高效靶向载体的可行性。方法：1．设计并合成融合多肽TAT-DV1-DEF以及对照多肽TAT-DV1和DEF。2．CCK-8细胞毒实验分析融合多肽TAT-DV1-DEF对人肺腺癌细胞系GLC-82生长的影响。3．激光共聚集显微镜观察TAT-DV1-DEF在细胞中的分布。4．流式细胞术分析融合多肽TAT-DV1-DEF进入细胞的效率和诱导细胞发生凋亡的凋亡率。5．DAPI染色并在荧光显微镜下观察融合多肽处理细胞后细胞核形态的变化。6．Westernblot实验检测凋亡发生相关蛋白Caspase-3。结果：1．CCK-8实验表明融合多肽TAT-DV1-DEF能特异抑制人肺腺癌细胞系GLC-82的生长，而对人胚肾细胞HEK-293生长无影响。2．流式细胞术和激光共聚焦显微镜均检测得到融合多肽TAT-DV1-DEF在处理GLC-821h后，能以几乎100%的效率进入细胞，分布在细胞质，主要与线粒体有共定位；而不带TAT的肽段DEF进入细胞的效率只有60.58%。3．融合多肽TAT-DV1-DEF处理人肺腺癌细胞系GLC-8272h后，DAPI染色显示细胞出现典型的凋亡核形态；流式细胞术显示细胞凋亡率随着TAT-DV1-DEF的浓度增加而增加。4．Westernblot实验结果表明，融合多肽TAT-DV1-DEF处理人肺腺癌GLC-82细胞系72h后发生了凋亡。结论：本研究尝试利用TAT-DV1作为高效靶向肿瘤载体进行未知肽段的功能研究，初步实验表明融合多肽TAT-DV1-DEF具有抗肿瘤活性，为进一步深入研究DEF打下了基础；TAT-DV1可以作为抗肿瘤药物传输的特异性高效载体，为融合多肽进一步深入研究指明了方向。
【作者】梁爱玲；
【导师】涂植光；刘新光；
【作者基本信息】重庆医科大学，临床检验诊断学，2014，博士
【关键词】融合多肽；CXCR4；TAT；DV1；乳腺癌；TAT-DV1；DEF；肺腺癌；

【参考文献】
[1]田原.基于Gabor小波变换和BP神经网络的人脸检测算法[D].内蒙古大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[2]黄琼施,黄秀峰,张晶,朱丽波,张信美.改良双瓣法病灶切除术在弥漫性子宫腺肌病中的应用分析[J].实用妇产科杂志,2014,08:605-608.
[3]木标.某客车车架结构性能分析及优化[D].合肥工业大学,车辆工程,2013,硕士.
[4]邱杰平.《瓦尔登湖》徐迟译本的生态翻译学阐释[D].华中师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[5]曾利.女性休闲会所体验设计研究[D].湖南工业大学,设计艺术学,2012,硕士.
[6]张凯峰.基于EAI的银行自助服务系统数据处理平台的研究[D].华北电力大学（北京）,2003.
[7]刘芳芬.水通道蛋白3与人皮肤成纤维细胞光老化的机制研究[D].中南大学,临床医学,2013,博士.
[8]伍玉林,文福拴,丁剑鹰,洪晖虹,李承军.发电公司在发电权交易市场的竞价策略初探[J].电力系统自动化,2010,17:6-11+16.
[9]史伟.社会主义和谐社会背景下的残疾人人文关怀研究[D].成都理工大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[10]付体鹏.猪样品中20种禁用兽药质谱检测方法的优化研究[D].西南大学,预防兽医学,2013,硕士.
[11]刘江平,姚姚.初始模型对CFP成像技术的影响研究[J].石油地球物理勘探,2005,02:143-148+157-119+252.
[12]晏峻.我国基础设施资产证券化问题研究[D].浙江工业大学,2005.
[13]文杏梓.基于用户需求的可信软件质量属性评价方法研究[D].中南大学,管理科学与工程,2013,博士.
[14]周银.采油建设项目经济后评价[D].吉林大学,会计,2012,硕士.
[15]蔡玲.KANO模型在软件项目风险管理中的应用研究[D].首都经济贸易大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[16]孙琳琳.粉尘浓度检测仪的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2012,硕士.
[17]陈伟.我国国有控股上市公司企业社会责任研究[D].湖北大学,伦理学,2012,硕士.
[18]韩文平.供应链免疫文化扩散与渗透机制的研究[D].吉林大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[19]夏飞.清末民初文人的代际更迭与小说变迁[D].复旦大学,中国文学批评史,2013,博士.
[20]宋真珍.我国政务微博管理问题研究[D].沈阳师范大学,行政管理,2013,硕士.
[21]陈威.室外智能变速云台摄像机的白盒测试—插桩技术[D].华中师范大学,电路与系统,2013,硕士.
[22]崔东安.基于奶牛胎衣不下基本病机—治则—疗效评价体系的中药复方制剂研究[D].中国农业科学院,基础兽医学,2014,博士.
[23]张诺.基于压缩感知的SAR运动目标和旋转微动目标检测方法[D].燕山大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[24]孙红侠.湖南移动客服中心员工激励机制研究[D].湖南大学,工商管理,2011,硕士.
[25]鲁守刚.黑龙江省三江平原生态地质环境评价[D].吉林大学,水利工程,2013,硕士.
[26]白玉宏.山西接骨木生存群落的数量分析[D].山西师范大学,生态学,2014,硕士.
[27]刘容.上市公司大股东股份增持的市场效应及增持动机研究[D].西北大学,会计学,2014,硕士.
[28]林创.马克思主义宗教观指导下的中国宗教法制建设[D].牡丹江师范学院,马克思主义基本原理,2012,硕士.
[29]章阿多.加氢空冷管束冲蚀特性模拟实验研究[D].浙江理工大学,机械电子工程,2013,硕士.
[30]林小竹,姚本全.弹性波虚谱法模拟[J].石油地球物理勘探,1991,06:688-699+799.
[31]李密.石墨烯复合材料的制备及其介电性能与导热性能的研究[D].上海交通大学,2013.
[32]陈晓范.无线Mesh网络路由协议研究[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2011,硕士.
[33]陈雄辩.汉语副词“还”、“再”、“又”与泰语相关词语对比分析及相关偏误研究[D].复旦大学,对外汉语教学,2012,硕士.
[34]刘晔.旅游合同法律问题研究[D].北方工业大学,民商法学,2014,硕士.
[35]丁振亭.大化肥德士古渣油气化碳黑洗涤设备的故障分析[J].石油化工设备.1993(06)
[36]范仲曦.建设银行深圳分行个人理财业务发展策略研究[D].大连理工大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[37]杨安琪.安徽省生猪出口比较优势分析[D].安徽农业大学,产业经济学,2012,硕士.
[38]赵彦青.基于CMP模型的“X BE X”认知研究[D].四川外国语大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[39]李庆欢.基于HTCPN的区域控制器列车追踪的建模研究[D].西南交通大学,交通信息工程及控制,2014,硕士.
[40]殷仲平.新世纪中国共产党文化使命视阈下的新疆文化建设研究[D].新疆师范大学,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[41]张瑞连.两种空间中的极小子流形[D].西南大学,基础数学,2014,硕士.
[42]王自珍.民主政治视野下的基层政协民主监督研究[D].华中师范大学,中外政治制度,2012,硕士.
[43]杨宇.埋地热力管道泄漏对大地温度场影响数值仿真分析[D].大庆石油学院,防灾减灾工程及防护工程,2004,硕士.
[44]梁光河.测井约束地震子波外推方法研究[J].石油地球物理勘探,1998,03:296-298+989-304+422.
[45]刘洪民,杨艳东.战略性新兴产业发展特征及其政策动态调整机制的构建[J].科学与管理,2014,06:66-70.
[46]李庆连.“农民荒”问题研究[D].安徽大学,社会学,2013,硕士.
[47]程建华.21世纪初期中国“国民国家安全意识”思考[D].吉林大学,公共管理,2004,硕士.
[48]王山山,李青仁,管叶君.约束模拟退火反演[J].石油地球物理勘探,1995,01:27-35+146.
[49]韩妍.异曲同工—郭秉文与廖世承师范教育思想比较研究[D].河北师范大学,教育学原理,2013,硕士.
[50]崔营.篆刻艺术对当代平面设计的启迪[D].湖南师范大学,设计艺术学,2013,硕士.