Importinβ蛋白负调节拟南芥microRNA活性机理研究

【摘要】microRNAs(miRNAs)是一类长度约为21个核苷酸的小分子RNAoDicerlikeproteinl(DCL1)切割具有茎环结构的miRNA前体(pri-miRNA)产生miRNAduplex,成熟的miRNA与ARGONAUTE1(AGO1)结合形成RNA沉默复合物(RNA-InducedSilencingComplexes,RISCs),指导切割靶mRNA或抑制靶蛋白翻译。MiRNAs在许多生物学过程中起重要的调控作用,包括调节生长发育,抵抗生物和非生物逆境以及维持基因组的稳定。作为重要的调节因子,miRNAs自身的活性也受到精细的调节。本文建立了一个正向遗传体系,用于筛选调控拟南芥(Arabidopsisthaliana)miRNA活性的新基因。我们首先获得一个高效稳定表达人工miRNA(amiR-trichome)的转基因系amiR-triOX,amiR-trichome的靶基因是三个控制表皮毛产生和分化的R3家族基因,CAPRICE(CPC)、TRIPTYCHON(TRY)和ENHANCERofTRIPTYCHONANDCAPRICE2(ETC2)。amiR-triOX转基因系中CPC和ETC2表达下降,导致植物叶片表皮毛成簇且根毛数目减少。利用表皮毛成簇这一显而易见的表型作为遗传标记,我们筛选得到了几十个miRNA活性减弱的突变体(compromisedmiRNAactivity,cmamutants)和miRNA活性加强的突变体(enhancedmiRNAactivity,emamutants),其中包括两个已知miRNA通路蛋白SERRATE(SE)的新突变体,说明该体系可以有效地分离拟南芥miRNA通路的突变体。本论文主要分析了一个ema突变体,emal。ema1-1突变体的表皮毛成簇程度明显增强,且人工miRNA和内源miRNAs的靶基因积累减少,说明EMA1广泛调节拟南芥miRNA的活性。图位克隆显示,ema1-1突变体中At2g31660基因的第十九个外显子和第十八个内含子交界处的G突变为A,该突变导致了基因的剪接错误。EMA1编码一个ImportinB蛋白。超表达EMA1导致miRNA靶基因积累增多,说明EMA1是一个负向调节miRNA功能的因子。遗传分析显示,emal可以部分挽救hyl1-2的表型而不能挽救ago1-25的表型,说明EMA1可能通过AGO1调节miRNA的活性。有意思的是,emal突变不影响AGO1和miRNA的积累以及它们在细胞核和细胞质中的分布,但emal突变体中AGO1结合更多的miRNA并具有更强切割靶mRNA的活性,这表明EMA1通过影响]miRNA进入AGO1形成RISC的效率来调节miRNA的活性。这些发现证实了EMAl是miRNA通路的一个负调节因子,并揭示了一种调节miRNA活性的新机制。
【作者】王伟；
【导师】戚益军；
【作者基本信息】北京协和医学院，生物化学与分子生物学，2011，博士
【关键词】miRNAs；AGO1；负调节因子；Importinβ；

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