干预RhoA/ROCK信号通路对急性脑缺血再灌注后出血转化的影响

【摘要】第一部分法舒地尔阻断ROCK对糖尿病和普通大鼠大脑中动脉缺血再灌注后出血转化的影响目的：rtPA溶栓治疗是急性脑梗死治疗的最有效手段。糖尿病降低了脑梗死后溶栓治疗血管再通率，使梗死面积缩小不明显，神经功能恢复困难，梗死出血转化明显增加。RhoA/ROCK信号通路和血管内皮功能相关。目前阻断ROCK对糖尿病大鼠脑梗死rtPA溶栓治疗后出血转化的影响和机制尚不明确。本研究拟建立普通大鼠和糖尿病大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，分别给予法舒地尔阻断ROCK，研究RhoA/ROCK信号通路对糖尿病大鼠缺血再灌注后血脑屏障通透性、出血转化影响，分析其可能机制。方法：将140只雄性SD大鼠随机分为假手术组（sham）20只，普通组和1型糖尿病组各60只。假手术组给予安慰剂加假手术处理。普通组和1型糖尿病组分别用线栓阻塞大鼠右侧大脑中动脉90分钟后给予rtPA尾静脉注射，120分钟拔栓再灌注，从而得到普通大脑中动脉缺血再灌注模型、糖尿病大脑中动脉缺血再灌注模型。对上述两组各随机分为两组(各30只)，分别给予生理盐水或法舒地尔干预，形成普通大脑中动脉缺血再灌注+生理盐水组（CIRS）、普通大脑中动脉缺血再灌注+法舒地尔组（CIRF）、糖尿病大脑中动脉缺血再灌注+生理盐水组（DMCIRS）、糖尿病大脑中动脉缺血再灌注+法舒地尔组（DMCIRF）。法舒地尔干预的两组在缺血再灌注的同时，腹腔注射5mg/kg的法舒地尔1次，继之梗死后12h注射1次，梗死后24小时注射1次，共3次。生理盐水对照的两组取相同体积的生理盐水代替法舒地尔腹腔注射。测定梗死后神经功能，缺血再灌注后24小时（梗死后26小时）ROCK蛋白活性、SOD、GSH-Px、MDA、基质金属蛋白酶MMP9、紧密连接蛋白occludin水平，以及相应血脑屏障通透性、出血转化情况。结果：和假手术组相比，4小时和26小时神经功能评分各组神经功能均增高（P<0.05）。CIRS组、CIRF组、DMCIRS组、DMCIRF组在梗死4小时后神经功能评分无统计学差异（P>0.05）。26小时后CIRS组、CIRF组神经功能评分低于DMCIRS组、DMCIRF组（P<0.05），CIRS组较CIRF组差（P<0.05），DMCIRS组较DMCIRF组差（P<0.05）。和假手术组相比，缺血后26小时TTC染色梗死体积在CIRS组、CIRF组、DMCIRS组、DMCIRF组均增高（P<0.05）。糖尿病大鼠组较普通组梗死严重（P<0.05），法舒地尔干预组较对照组梗死轻（P<0.05）。脑缺血再灌注24h后（梗死后26小时）CIRS组缺血侧脑组织内血红蛋白含量明显多于CIRF组（447.83±44.15μg/gvs.303.33±52.03μg/g，P<0.05），DMCIRS组缺血侧脑组织内血红蛋白含量明显多于DMCIRF组和CIRS组（646.67±97.71μg/gvs.496.67±61.54μg/gvs303.33±52.03μg/g，P<0.05）。DMCIRF组缺血侧脑组织内血红蛋白含量明显多于CIRF组（496.67±61.54μg/gvs.303.33±52.03μg/g，P<0.05）。同时，CIRS组缺血侧脑组织内EB含量明显多于CIRF组（4.98±0.43μg/gvs.3.26±0.73μg/g，P<0.05），DMCIRS组缺血侧脑组织内EB含量明显多于DMCIRF组和CIRS组（7.01±1.02μg/gvs.5.50±0.47μg/gvs4.98±0.43μg/g，P<0.05）。DMCIRF组缺血侧脑组织内EB含量明显多于CIRF组（5.50±0.47μg/gvs.3.26±0.73μg/g，P<0.05）。脑缺血再灌注24h后CIRS组缺血侧脑组织内occludin表达明显少于CIRF组（P<0.05），DMCIRS组缺血侧脑组织内occludin表达明显少于DMCIRF组（P<0.05）和CIRS组（P<0.05）。DMCIRF组缺血侧脑组织内occludin表达明显低于CIRF组（P<0.05）。脑缺血再灌注24h后大鼠缺血侧大脑组织MMP9表达增加，糖尿病大鼠两组较高（P<0.05），法舒地尔干预两组缺血侧脑组织内MMP9表达明显高于对照两组组（P<0.05）。糖尿病大鼠两组缺血侧脑组织内ROCK活性高于普通大鼠两组（P<0.05），法舒地尔干预两组缺血侧脑组织内ROCK活性小于对照两组（P<0.05）。脑缺血再灌注24h后大鼠缺血侧大脑组织SOD、GSH-Px减少，MDA增加，DMCIRS组最为明显。相比CIRS组，DMCIRS组缺血侧脑组织内SOD、GSH-P降低，MDA增高（P<0.05）（P<0.05），说明糖尿病增加了脑缺血再灌注后氧化应激反应。相比CIRS组，CIRF组缺血侧脑组织内SOD、GSH-P较高，MDA较低（P<0.05）；相比DMCIRS组，DMCIRF组缺血侧脑组织内SOD、GSH-P较高，MDA较低（P<0.05）。结论：在糖尿病和非糖尿病大鼠大脑中动脉缺血再灌注后，法舒地尔干预后ROCK活性下降，MMP9表达增加，occludin降解减少，血脑屏障通透性下调，出血转化减少，提示RhoA/ROCK信号通路在脑缺血再灌注过程中对血脑屏障的作用部分通过MMP9完成。氧化应激水平在糖尿病大鼠中缺血再灌注过程中较高，是血脑屏障破坏因素。法舒地尔干预降低了氧化应激水平，提示RhoA/ROCK信号通路在脑缺血再灌注过程中对血脑屏障的作用也和氧化应激部分相关。第二部分激动PPARr调节RhoA活性对大鼠大脑中动脉缺血再灌注后出血转化的影响目的：已有研究表明PPARγ激动剂吡格列酮有脑保护作用。脑缺血再灌注后RhoA/ROCK信号通路激活对血脑屏障有破坏作用。血管内皮细胞内PPARγ促进泛素途径对RhoA降解，降低RhoA活性。本研究通过观察激动、沉默、沉默后激动PPARγ对脑缺血再灌注后RhoA/ROCK信号通路、血脑屏障通透性相关指标、出血转化的影响，分析相关机制。方法：将140只雄性SD大鼠随机分为假手术组（sham）20只和模型组120只。假手术组给予安慰剂加假手术处理。模型组用颅内注射慢病毒介导PPARγRNA干扰来沉默内源性PPARγ基因，用慢病毒空载体对照。用来吡格列酮激动PPARγ，用吡格列酮的溶剂DMSO对照。模型组随机分为6组，每组20只，分别是：（1）缺血再灌注+安慰剂组（CIRP）：制备MCAO缺血再灌注模型，再灌注时给予DMSO腹腔内注射（体积等同于吡格列酮/DMSO溶液），梗死后12小时重复给予1次，24小时重复给予1次。（2）缺血再灌注+空载体组（CIRV）：梗死前7天颅内注射慢病毒空载体（体积等同于PPARγsiRNA慢病毒载体），饲养7天后制备MCAO缺血再灌注模型。（3）缺血再灌注+空载体组+安慰剂（CIRVP）：梗死前7天颅内注射慢病毒空载体（体积等同于PPARγsiRNA慢病毒载体），饲养7天后制备MCAO缺血再灌注模型，再灌注时给予DMSO腹腔内注射（体积等同于吡格列酮/DMSO溶液），梗死后12小时重复给予1次，24小时重复给予1次。（4）缺血再灌注+siRNA组（CIRI）：梗死前7天颅内注射siRNA慢病毒载体，饲养7天后制备MCAO缺血再灌注模型，再灌注时给予DMSO腹腔内注射（体积等同于吡格列酮/DMSO溶液），梗死后12小时重复给予1次，24小时重复给予1次。（5）缺血再灌注+siRNA+PPARγ激动组（CIRIA）：颅内注射siRNA慢病毒载体，饲养7天后制备MCAO缺血再灌注模型，再灌注时给予吡格列酮/DMSO溶液腹腔内注射，梗死后12小时重复给予1次，24小时重复给予1次。（6）缺血再灌注+PPARγ激动组（CIRA）：制备MCAO缺血再灌注模型，再灌注时给予吡格列酮/DMSO溶液腹腔内注射，梗死后12小时重复给予1次，24小时重复给予1次。检测缺血后26小时（再灌注后24小时）后RhoA活性、ROCK活性氧化应激水平、MMP9表达、occludin表达的影响，以及相应血脑屏障通透性、出血转化情况。结果：相比对照大鼠，沉默内源性PPARγ基因的大鼠降低PPARγ蛋白表达。在大脑中动脉缺血再灌注后，沉默内源性PPARγ基因的大鼠脑组织内RhoA活性增加，ROCK活性增加，MMP9表达增加，血管内皮紧密连接蛋白occludin降解加重，SOD、GSH-Px明显减少，MDA明显增加，缺血再灌注后出血转化增多和血脑屏障通透性上升。与之对应的是在大脑中动脉缺血再灌注后，吡格列酮激动PPARγ受体，导致大鼠脑组织内RhoA活性下降，ROCK活性下降，MMP9表达减少，血管内皮紧密连接蛋白occludin表达增加，SOD、GSH-Px明显增加，MDA明显下降，缺血再灌注后出血转化减少和血脑屏障完整性改善。但吡格列酮激动沉默了内源性PPARγ基因的大鼠则没有保护血脑屏障作用，其指标表现和沉默内源性PPARγ基因的大鼠一样。结论：PPARγ受体在调控血脑屏障通透性上有关键性作用，PPARγ可通过调节RhoA活性，影响RhoA/ROCK信号通路，改变氧化应激和MMP9水平，对脑缺血再灌注过程后的血脑屏障通透性进行调控，影响缺血再灌注后出血转化。
【作者】李隆龄；
【导师】李长清；
【作者基本信息】重庆医科大学，神经病学，2014，博士
【关键词】糖尿病；缺血再灌注；血脑屏障；ROCK；法舒地尔；PPARγ；RhoA；脑局部缺血再灌注；吡格列酮；

【参考文献】
[1]靳卫霞.基于观念建构的“盐类的水解”教学设计与实施[D].山东师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[2]薛万利.基于Gabor特征的疲劳识别和分析[D].天津大学,软件工程,2013,硕士.
[3]邬宇航.亚急性瘤胃酸中毒对瘤胃、瓣胃上皮细胞增殖与凋亡的影响[D].内蒙古农业大学,预防兽医学,2013,硕士.
[4]郝晓春.上市银行对中小企业融资支持效率的实证研究[D].长安大学,会计学,2014,硕士.
[5]王栋.多巴胺复合膜的制备及其在海水养殖废水处理中的应用[D].中国海洋大学,应用化学,2014,硕士.
[6]梁小明.金属钴纳米粒子和钴镍合金的合成及其在水处理方面的应用研究[D].吉林大学,材料学,2014,硕士.
[7]马海娥.复合型生物质型煤的配方设计[D].宁夏大学,化学工程（专业学位）,2014,硕士.
[8]张科.办公建筑冷热电联供系统配置方案优化研究[D].哈尔滨工业大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2013,硕士.
[9]刘光穆,马国军,茅洪祥.四级锚链钢的实验室研究[J].钢铁研究.2002(05)
[10]康继光,卫振林,程丹明,徐凡.电动汽车充电模式与充电站建设研究[J].电力需求侧管理,2009,05:64-66.
[11]张广芳.社会资本与我国社会主义新农村建设问题研究[D].山东师范大学,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[12]鲍城志,王钟琪,周剑鸣,邹揆南,姚筱亦,奚传铮.动力系统事故分析和处理的逻辑控制[J].自动化学报,1964,02:119-122.
[13]王丹.浅议电子政务下知识管理的核心问题——政务资源整合[J].电子政务,2005,13:63-67.
[14]陈阳.小行星探测器着陆段自主光学导航方法研究[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[15]宋睿卓,肖文栋,孙长银.基于数据ADP算法的一类带有执行器饱和的未知离散时间系统最优跟踪控制(英)[J].自动化学报,2013,09:1413-1420.
[16]靳少华,李忠厚,闫志强.我国机车修制改革的新突破[J].中国铁路.2002(11)
[17]江磊.线粒体DNA中D-Loop突变在非小细胞肺癌中的意义[D].蚌埠医学院,外科学,2013,硕士.
[18]马妍如.双边市场的捆绑销售策略研究[D].首都经济贸易大学,产业经济学,2014,硕士.
[19]谭理.东亚一体化的可行性研究[D].湖南师范大学,国际政治,2014,硕士.
[20]钟定国,卢丹.家长式领导行为对员工工作投入的影响作用—基于领导成员交换的中介作用[J].西安工业大学学报,2014,01:57-63.
[21]温晓兰.河北省居民旅游购物和娱乐消费的影响因素分析[D].河北经贸大学,产业经济学,2012,硕士.
[22]李寿桥.C市新型农村社会养老保险调查研究[D].兰州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[23]厉青.油气地质异常信息挖掘与定量分析研究[D].中国地质大学（北京）,2003.
[24]赵予兵.人力资源开发的现状、问题及对策研究—以吉化公司为例[D].吉林大学,行政管理,2004,硕士.
[25]张斌.社会性别视阈下陈其钢的两部管弦乐作品《五行》、《蝶恋花》的比较分析[D].中央音乐学院,中国近现代（含当代）音乐史,2012,硕士.
[26]张俊.稀土氧化物纳米阵列的可控制备及荧光性能研究[D].安徽大学,应用化学,2014,硕士.
[27]刘婧.试论中西方空间叙事异同[D].西北大学,美学,2014,硕士.
[28]傅连春,孙勤刚,陈福军,廖红军.武钢炼铁厂5~#BF炉顶布料模型优化[J].冶金自动化,2002,02:27-30+37.
[29]刘效姬.中国政府公共危机管理善后处理阶段问题研究[D].黑龙江大学,公共管理,2013,硕士.
[30]雷建伟.静载下结构参数识别的误差分析和概率方法[D].哈尔滨工业大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[31]罗勇.风力发电并网变流器直接功率控制研究[D].北京交通大学,2008.
[32]侯晓丹.韩汉全称量化副词“（？）”和“都”的对比研究[D].上海外国语大学,亚非语言文学,2013,硕士.
[33]张芳.PM体制下极化分集合成技术的研究[D].燕山大学,电路与系统,2004,硕士.
[34]朱芳.評《新華字典》第11版[D].南京大学,漢語言文字學,2013,硕士.
[35]冯娟.基于出口收入不稳定性的中国大蒜企业出口市场环境研究[D].华中农业大学,企业管理,2014,硕士.
[36]王志群,朱守真,周双喜,黄仁乐,王连贵.分布式发电对配电网电压分布的影响[J].电力系统自动化,2004,16:56-60.
[37]谢军.KOH/SnO_2固体超强碱的制备、表征和催化应用[D].湖南大学,2014.
[38]刘艾.我国遗嘱信托法律问题研究[D].中国社会科学院研究生院,经济法（专业学位）,2014,硕士.
[39]王楠,律方成,李和明.OLAP技术在电气设备在线监测数据处理中的应用[J].电力系统自动化,2004,03:71-73+85.
[40]程丽丽.城市空巢老人多元化养老服务及其问题研究[D].内蒙古师范大学,社会工作（专业学位）,2013,硕士.
[41]靖培星.井工煤矿绿色矿山评价指标体系研究[D].中国矿业大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[42]张文颖.基于.NET框架的婚恋交友系统的设计与实现[D].南昌大学,计算机技术,2012,硕士.
[43]马晓科.外商直接投资（FDI）对中国收入差距的影响[D].复旦大学,世界经济,2012,博士.
[44]胡英娜.我国纺织业财务综合评价体系优化及应用研究[D].中国海洋大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[45]金继东,郑毓蕃.有向网络下线性多个体系统的整体行为——矩阵方法[J].控制与决策,2011,05:661-666.
[46]石长平.人文精神：诗歌的价值体认与诗歌教学的价值取向[D].华中师范大学,学科教学论,2003,硕士.
[47]奇旭日.鄂尔多斯市准格尔旗薛家湾城市建设用地规模研究[D].内蒙古师范大学,人文地理学,2012,硕士.
[48]陈峰.基于Java RMI的分布式数据库系统的应用与研究[D].武汉理工大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[49]姚栋财.论有限责任公司关联交易的法律规制[D].郑州大学,民商法学,2013,硕士.
[50]赵艳娇.旋流式反循环连续取心钻头结构设计及孔底流场CFD分析[D].吉林大学,地质工程,2012,硕士.