两种青蒿素衍生物毒理学再评价及其心脏毒性机制研究

【摘要】目的和意义：青蒿素及其衍生物是临床上治疗疟疾的一线药物，目前已经用于治疗多种原虫感染，动物和细胞试验证实青蒿素类衍生物还具有抗肿瘤、抗炎和调节免疫等药理作用。为了扩大青蒿素类药物的临床适应症，迫切需要开展临床前试验研究，以支持临床用药。本课题研究目的是观察青蒿素衍生物在低剂量长期给药时的毒性反应和靶器官，以及心脏毒性作用机制，为临床安全合理用药提供支持。材料与方法：试验采用Beagle犬64只，随机分为空白对照组、青蒿琥酯口服给药组（6mg/kg）、肌肉注射溶剂对照组和蒿甲醚肌肉注射组（6mg/kg）。每组16只动物，雌雄各半。每周给药6次，连续给药13周，分别在给药第4周、第8周和给药结束每组分别剖杀雌、雄各2只动物。剩余动物继续观察2、4周后剖杀。检查项目包括：一般临床指标观察（包括体重、摄食量、体温、心电图及神经行为学），眼科检查，血液学和血生化指标检测，骨髓涂片检查，尿液检查，组织病理学检查（包括全部脏器，神经系统和心脏传导系组织作为重点观察），超微病理学检查（肝脏、心脏和肾脏）和伴随毒代动力学研究。采用膜片钳技术观察青蒿素对CHODUO细胞hERG通道的影响。结果：（1）一般临床观察指标：动物体重、摄食量、眼科检查和尿液检查均未见异常，未见神经行为学症状（震颤、麻痹、呕吐、共济失调、听力和视觉障碍等）出现。（2）注射部位改变：肌肉注射蒿甲醚后，从实验第4天起部分动物双后肢注射部位发红、变硬、轻度肿胀。之后持续加重，2周后全部动物双后肢注射部位均呈发红、发硬、肿胀等表现。蒿甲醚组症状明显重于溶剂对照组。恢复4周后注射部位上述表现明显减轻。（3）心电图检查发现：在W-1，W1，W3，W5，W7，W9，W11，W13，W15和W17测定心电图，记录HR、PR、QRS和QT相关测量数据，根据QT500=QT-0.084×(RR-500)公式对QT进行校正（由于PQ和QT间期随心率快慢而变化，根据心率为120次/分钟RR间期为500毫秒进行矫正），蒿甲醚肌肉注射组与溶剂对照组相比QT间期明显延长（P<0.05）；而青蒿琥酯口服组与空白对照组相比心率明显降低（P<0.05）。（4）血液学检查发现：肌肉注射溶剂对照组和蒿甲醚肌肉注射组WBC、NE%、MO%指标升高，而青蒿琥酯口服组和蒿甲醚肌肉注射组均可见部分动物红细胞计数下降（W2）和网织红细胞计数改变（蒿甲醚肌肉注射组部分动物RET%显著增加，青蒿琥酯口服组部分动物RET%显著下降）。（5）血生化指标发现：蒿甲醚肌肉注射组见AST、CK升高，Na+下降；而肌肉注射溶剂对照组和蒿甲醚肌肉注射组均可见A/G比例下降，K+下降。（6）骨髓细胞涂片镜检发现：蒿甲醚肌肉注射组W4时原始、早幼粒细胞显著减少，W8至W12杆状、分叶粒细胞显著减少，W8时红系造血细胞增加，以中晚期红细胞为主。青蒿琥酯口服组在W8原始早幼粒细胞显著减少。恢复期上述变化均恢复正常。（7）病理大体检查发现：肌肉注射溶剂对照组和蒿甲醚肌肉注射组均可见注射部位形成硬结，皮下出血，纵切剖开可见肌间灰白色条索状组织。（8）组织病理学检查发现：W4时青蒿琥酯口服组和蒿甲醚肌肉注射组部分动物骨髓出现抑制，主要表现为红系受抑，红细胞成熟障碍，幼稚红细胞增多，成熟红细胞减少；之后有加重趋势，直至给药结束。W4时青蒿琥酯和蒿甲醚组均在脾脏出现髓外造血灶，至W8和W13髓外造血灶呈增多趋势。W4、W8青蒿琥酯组各见1只动物十二指肠上皮坏死脱落，肠隐窝扩张。W8蒿甲醚组出现大脑皮层神经元变性坏死（2/4）和脊髓灰质神经元变性坏死（3/4），至W17时，仍有1/4只动物查见大脑皮层及脊髓神经元变性坏死。与对照组相比，蒿甲醚肌肉注射组注射部位病理损伤明显加重。（9）心脏传导系检查发现：W8时青蒿琥酯口服组个别动物心脏窦房结可见慢性炎症改变，并有少量脂肪浸润；W13时可见2/4动物房室结P、T细胞空泡变性，W17时未见明显异常。蒿甲醚肌肉注射组心脏传导系统未见明显异常。（10）超微结构检查发现：W4时青蒿琥酯和蒿甲醚组均可见心、肝、肾等脏器细胞线粒体肿胀、空泡化等改变，W8、W13仍然可见，至恢复期结束上述改变尚未完全恢复。（11）伴随毒代动力学研究表明：青蒿琥酯和蒿甲醚在体内均代谢为二氢青蒿素（DHA）。在D1、D15和D28血中蒿甲醚浓度能够进行曲线拟合，计算D1和D5AUC(0-t)，t1/2z和Tmax的数据。结果显示，蒿甲醚肌肉注射组：蒿甲醚反复给药28天，体内蒿甲醚吸收加快，消除加快，但暴露量变化不大；而在D58和D93体内蒿甲醚和DHA暴露逐渐降低。青蒿琥酯口服组：青蒿琥酯及其代谢产物DHA的暴露量较稳定。另外，在相同剂量（6mg/kg）下，与肌肉注射蒿甲醚相比，青蒿琥酯组体内DHA的暴露相对较高。（12）hERG通道检测：采用全自动膜片钳技术，以表达hERG钾通道的CHO细胞为标本，观察不同浓度的青蒿琥酯和蒿甲醚对hERG钾通道的影响。发现青蒿琥酯的IC50分别为5.51±5.40mM(n=3)，认为青蒿琥酯对hERG钾通道没有明显的阻断作用；而蒿甲醚对hERG钾通道具有阻断作用，其IC50为124.91±55.19μM（n=3）。结论：（1）青蒿琥酯和蒿甲醚都能引起Beagle犬骨髓抑制和外周血红细胞计数减少、脾脏髓外造血，以上变化最早出现在W2，是出现最早的敏感指标。（2）青蒿琥酯和蒿甲醚对心脏形态和功能均有影响，但是表现不同：青蒿琥酯能导致心脏传导系（窦房结和房室结）P细胞和T细胞变性和炎症改变，心电图显示心率显著下降；而蒿甲醚则导致QT间期延长，其作用机制很可能与hERG通道被抑制有关。（3）青蒿琥酯和蒿甲醚都可导致心肌细胞、肝细胞和肾小管上皮细胞线粒体等超微结构出现不同程度的肿胀、空泡变等损伤，表明线粒体是其作用的靶点之一。（4）蒿甲醚肌肉注射后可导致注射部位局部出现明显的炎症反应。（5）蒿甲醚组可见大脑皮层和脊髓灰质神经元散在轻度变性坏死，受损神经元细胞尼氏体减少或消失，但未见神经行为学改变。（6）反复肌肉注射蒿甲醚使局部肌肉出现损伤而影响了药物的吸收，从而导致给药后期AUC下降和毒性作用时间延长，可能是蒿甲醚引起神经毒性的重要影响因素。
【作者】尹纪业；
【导师】丁日高；王和枚；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，卫生毒理学，2014，博士
【关键词】青蒿琥酯；蒿甲醚；心脏毒性；安全性评价；hERG通道；

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