Grhl2抑制胃癌生物学特性及其分子机制的研究

【摘要】背景胃癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，严重影响着人类的生命健康。尽管近年来其发病率在全世界范围内有下降趋势，但仍然是癌症相关死亡的一个主要原因，其死亡率在男性和女性恶性肿瘤中分别排在第二位和第四位。外科手术切除是目前针对早期胃癌最有效的治疗手段。然而，大部分的患者就医时已发展为中晚期，预后较差，即使联合运用放疗、化疗等综合治疗措施，其总体生存率也并不满意。近年来，对肿瘤相关基因及其通路的研究使得肿瘤的预防和治疗取得了巨大进展，这也必将是今后肿瘤研究的方向。Grhl2（Grainyhead-like2）属于grainyhead-like转录因子家族成员之一，是果蝇grainyhead在哺乳动物中的同源物。研究表明该家族成员在生长发育、神经管闭合以及上皮细胞分化等多个方面都起着重要的作用。随着研究的深入，Grhl家族成员，尤其是Grhl2在肿瘤发生发展中的作用也日益受到重视。现有的研究成果表明Grhl2一方面能促进乳腺癌、口腔鳞状细胞癌以及肝癌的恶性发展，而另一方面又能抑制乳腺癌中的上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransitions,EMT)从而抑制肿瘤进程。然而，关于Grhl2在胃癌中的表达情况及其作用还未见文献报道，因而具有非常大的研究价值。目的本研究旨在对胃癌细胞和组织中Grhl2的表达情况进行检测，根据胃癌中Grhl2的表达情况评估其在胃癌发生发展过程中的作用；结合相关文献报道初步探讨Grhl2影响胃癌发生发展的潜在分子机制；总之，最终期望能通过本项研究为胃癌的预防和治疗提供一条新的线索。方法（1）免疫组化检测48对胃癌及其周围正常组织中Grhl2表达；qPCR和Western-blot检测Grhl2在胃癌和正常胃上皮细胞株中的表达情况，分析各组间Grhl2的表达差异。（2）构建过表达Grhl2的慢病毒载体，转染目的胃癌细胞株并建立稳定株；选取Grhl2低表达的胃癌细胞株进行下一步实验。采用MTT、流式细胞术及Transwell侵袭迁移实验分别检测Grhl2过表达后细胞增殖、凋亡和侵袭迁移能力的改变情况；建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察Grhl2对胃癌移植瘤生长的影响。（3）Western-blot检测细胞增殖相关蛋白c-myc、凋亡相关蛋白Bcl-2以及侵袭转移相关的蛋白MMP2在Grhl2过表达前后的表达变化情况；用TGF-β信号通路抑制剂LY364947抑制胃癌细胞内TGF-β信号后检测Grhl2的蛋白表达变化；在Grhl2过表达细胞株中采用TGF-β信号通路激动剂TGF-β1处理细胞后，观察Grhl2对TGF-β信号通路及其所诱导的EMT的影响。结果（1）与其相应的癌旁组织和正常胃上皮细胞比较，Grhl2在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达明显下调，差异具有统计学意义；此外，Grhl2在胃癌中低表达还与胃癌的淋巴结转移、TNM分期具有显著相关性。（2）成功构建了Grhl2过表达的慢病毒载体，将其转染低表达Grhl2的胃癌细胞株SGC7901细胞并建立了稳定株；Grhl2过表达不仅在体外细胞水平能抑制细胞增殖、促进癌细胞凋亡、降低癌细胞侵袭迁移能力，还能在体内抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。（3）Grhl2过表达后，细胞增殖、凋亡和侵袭转移相关蛋白c-myc、Bcl-2、MMP2的表达下调；抑制胃癌细胞内TGF-β信号通路能恢复Grhl2的表达；此外，Grhl2过表达可阻断TGF-β信号通路，抑制TGF-β所诱导的EMT。结论Grhl2在胃癌中表达下调；过表达Grhl2可显著地抑制胃癌生物学特性；Grhl2可通过下调c-myc、Bcl-2、MMP2的表达和抑制TGF-β信号通路及其所诱导的EMT从而发挥其对肿瘤的抑制作用。
【作者】向吉锋；
【导师】王子卫；
【作者基本信息】重庆医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】Grhl2；TGF-β；生物学特性；胃癌；

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