Apelin-13通过ABCA1改善APP/PS1小鼠的认知与记忆功能

【摘要】阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）是一种发病率较高、危害性较大的神经系统退行性疾病，其主要临床特征为进行性认知和记忆功能减退。β-淀粉样蛋白（β-Amyloidprotein，Aβ）在脑内的生成和沉积所形成的老年斑（senileplaque，SP）在AD的病理过程中起重要的作用。Aβ生成增加、酶介导的Aβ降解不足以及Aβ从脑内清除减少是导致Aβ聚集的重要原因。过量的Aβ聚集后形成淀粉样沉积和老年斑，从而产生神经毒性，出现认知及记忆功能损害。三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATPbindingcassettetransporterA1，ABCA1）与Aβ代谢联系紧密。ABCA1蛋白缺失会导致脑内载脂蛋白E（apolipoproteinE，apoE）荷脂减少和Aβ水平增加。ABCA1蛋白过表达会增加脑内apoE荷脂和减少Aβ水平，进而对AD产生影响。ABCA1高表达时，Aβ生成减少，降解和清除增加。鉴于ABCA1在Aβ的代谢和集聚中起非常重要作用，可以将ABCA1作为治疗AD的一个重要靶点。因此，寻找一种能有效增加ABCA1表达的物质变得至关重要。Apelin是脂肪细胞分泌的一种具有生物活性的肽类激素，在体内具有广泛的组织学分布。近来研究表明，Apelin在海马神经元保护过程中起重要的作用。基于海马神经元在学习与记忆中具有重要的地位，提示apelin对学习记忆具有调节作用。我们前期研究表明，Apelin-13增加THP-1源性巨噬细胞ABCA1水平，但其对Aβ代谢的作用目前尚不清楚。鉴于ABCA1蛋白与Aβ代谢之间的密切关系，我们提出以下假设：apelin-13通过增加ABCA1蛋白水平减少Aβ沉积及改善AD模型鼠认知与记忆功能。本课题分三个部分来验证假设，第一部分使用apelin-13处理大鼠嗜铬细胞瘤细胞株（PC-12细胞，具有神经内分泌细胞特性），观察apelin-13是否通过影响ABCA1蛋白水平从而调节PC-12细胞Aβ代谢，并阐明其机制。第二部分使用apelin-13处理APP/PS1转基因小鼠，观察apelin-13是否改善AD模型鼠的认知记忆功能及减少其Aβ沉积。第三部分使用ABCA1SiRNA沉默APP/PS1转基因小鼠脑组织ABCA1表达，观察apelin-13是否通过ABCA1蛋白改善AD模型鼠的认知记忆功能及减少其Aβ沉积。本研究对AD的防治提供了一个新的实验依据。第一部分Apelin-13增加PC-12细胞ABCA1蛋白水平调节Aβ代谢目的：观察apelin-13是否通过影响ABCA1蛋白水平从而调节Aβ代谢，并阐明其机制。方法：①Westernblot检测PC-12细胞血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白（putativereceptorproteinrelatedtotheangiotensinreceptorAT1，APJ）表达，以确定PC-12细胞存在apelin-13作用受体。②用不同浓度（1、10、100nmol/L）的apelin-13处理PC-12细胞24h及用100nmol/Lapelin-13处理细胞24不同时间（12h、24h、48h）后，酶联免疫吸附法（ELISA）检测Aβ1-40及Aβ1-42水平，Westernblot免疫印迹法检测APP、BACE1及NEP蛋白水平，根据试剂盒方法检测BACE1及NEP酶活性，RT-PCR检测ABCA1mRNA水平，WesternBlot检测ABCA1蛋白水平，液体闪烁计数法检测细胞内胆固醇的流出。③先使用ABCA1SiRNA抑制PC-12细胞ABCA1蛋白表达，再使用100nmol/Lapelin-13处理PC-12细胞24h，ELISA检测Aβ1-40及Aβ1-42水平，根据试剂盒方法检测BACE1及NEP酶活性。以确定ABCA1在apelin-13对PC-12细胞Aβ代谢影响中所起的作用。④先使用PKCαSiRNA抑制PKCα表达，再使用100nmol/Lapelin处理PC-12细胞24h，检测apelin对ABCA1蛋白水平的影响。使用不同浓度（1、10、100nmol/L）的apelin-13处理PC-12细胞24h，检测钙调蛋白（calpain）活性。⑤使用不同浓度（1、10、100nmol/L）apelin-13处理PC-12细胞24h，Westernblot方法检测apoE蛋白表达水平。使用apoESiRNA抑制apoE表达，100nmol/Lapelin处理PC-12细胞24h，检测apelin对BACE1及NEP酶活性的影响。结果：①PC-12细胞存在APJ表达。②Apelin-13显著降低PC-12细胞Aβ1-40及Aβ1-42水平，对APP、BACE1及NEP蛋白表达无显著影响，降低BACE1酶活性，增加NEP酶活性，对ABCA1mRNA水平无影响，增加ABCA1蛋白水平，促进胆固醇流出，减少细胞内脂质蓄积。③使用ABCA1SiRNA抑制PC-12细胞ABCA1蛋白表达后，apelin-13降低PC-12细胞Aβ1-40及Aβ1-42水平的作用显著减弱，其降低BACE1酶活性及增加NEP酶活性的作用显著抑制。④使用PKCαSiRNA抑制PC-12细胞PKCα表达后，apelin增加ABCA1蛋白水平的作用减弱；Apelin-13显著抑制PC-12细胞calpain活性。⑤Apelin-13对PC-12细胞apoE蛋白表达无显著影响；使用apoESiRNA抑制PC-12细胞apoE表达后，apelin-13降低BACE1酶活性及增加NEP酶活性的作用显著减弱。结论：①Apelin-13通过PKCα途径增加PC-12细胞ABCA1蛋白水平；②Apelin-13通过增加PC-12细胞ABCA1蛋白水平，降低BACE1活性减少Aβ生成、增强NEP活性增加Aβ降解，从而减少Aβ水平。第二部分Apelin-13改善APP/PS1小鼠认知与记忆功能目的：观察apelin-13是否影响APP/PS1小鼠认知与记忆功能及脑组织Aβ代谢。方法：用不同剂量（1、2、4μg）的apelin-13侧脑室注射处理APP/PS1小鼠30天（1次/天）后，Y迷宫实验、新物体识别实验及Morris水迷宫实验检测小鼠认知与记忆功能。随后处死小鼠，ELISA检测小鼠海马和前额叶组织的Aβ1-40及Aβ1-42水平，刚果红染色检测海马组织Aβ沉积情况，Westernblot检测海马和前额叶组织APP、BACE1及NEP蛋白水平，根据试剂盒方法检测海马和前额叶组织BACE1及NEP酶活性，ELISA检测小鼠外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平，Westernblot检测海马和前额叶组织ABCA1蛋白水平。结果：Apelin-13显著提高APP/PS1小鼠在Y迷宫实验中的正确率，显著增加APP/PS1小鼠在新物体识别实验中（无论是短时检测还是长时检测）对新物体的认知能力，并且显著减少APP/PS1小鼠在Morris水迷宫实验中的平均游泳距离及平均潜伏期。Apelin-13显著降低APP/PS1小鼠海马和前额叶组织的Aβ1-40及Aβ1-42水平，对APP、BACE1及NEP蛋白水平无显著影响，减少海马和前额叶组织BACE1酶活性，增加NEP酶活性，显著增加外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平，显著提高海马和前额叶组织ABCA1蛋白水平。结论：①Apelin-13改善APP/PS1小鼠的认知与记忆功能；②Apelin-13减少APP/PS1小鼠海马和前额叶组织Aβ生成，增加Aβ降解及清除。③Apelin-13增加APP/PS1小鼠海马和前额叶组织ABCA1蛋白水平。第三部分Apelin-13通过ABCA1改善APP/PS1小鼠的认知与记忆能力目的：观察apelin-13是否通过ABCA1蛋白影响APP/PS1小鼠认知与记忆功能及脑组织Aβ代谢。方法：使用ABCA1SiRNA侧脑室注射沉默APP/PS1小鼠脑组织ABCA1蛋白表达，观察apelin-13对AD模型小鼠认知与记忆功能及脑组织Aβ代谢的影响。Y迷宫实验、新物体识别实验及Morris水迷宫实验检测小鼠认知与记忆功能。处死小鼠，ELISA检测小鼠海马和前额叶组织的Aβ1-40及Aβ1-42水平，刚果红染色检测海马组织Aβ沉积情况，试剂盒检测海马和前额叶组织BACE1及NEP酶活性，ELISA检测小鼠外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平。结果：当脑组织ABCA1表达被沉默后，Apelin-13对APP/PS1小鼠认知记忆功能及脑组织Aβ沉积的改善作用减弱，Apelin-13对APP/PS1小鼠海马和前额叶组织BACE1活性的抑制作用及对NEP活性的促进作用降低，Apelin-13增加外周血Aβ1-40及Aβ1-42水平的效应下降。结论：①Apelin-13通过增加ABCA1蛋白水平改善APP/PS1小鼠的认知与记忆功能；②Apelin-13通过增加ABCA1蛋白水平减少APP/PS1小鼠海马和前额叶组织Aβ生成，增加Aβ降解及清除。
【作者】欧阳新平；
【导师】唐朝克；
【作者基本信息】南华大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】Apelin-13；三磷酸腺苷结合盒A1；阿尔茨海默病；β-淀粉样蛋白；

【参考文献】
[1]李梦洁.重庆S物业管理公司员工离职影响因素及控制对策研究[D].西南大学,企业管理,2014,硕士.
[2]朱雪青.中国企业域外破产的承认与争端解决[D].上海交通大学,法律,2013,硕士.
[3]霍存霞.对嵌入AHBS模型中的波动率函数稳定性探索[D].华中师范大学,应用数学,2014,硕士.
[4]孙洁.城市历史性住区空间异化现象研究[D].华中科技大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[5]夏栋.电动舵机伺服机构动力学特性研究[D].哈尔滨工业大学,动力机械及工程,2014,硕士.
[6]李超.内蒙古环境立法研究[D].中南林业科技大学,环境与资源保护法学,2014,硕士.
[7]谢光跃.黑素细胞分布规律及基因差异表达[D].华中农业大学,动物遗传育种与繁殖,2014,硕士.
[8]王飞.热熔胶材料在路面粘层油中的应用研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[9]王绍伟.内蒙古PVC行业汞污染现状调查与防治研究[D].内蒙古师范大学,环境科学,2012,硕士.
[10]罗昊.社会网络中的时空周期行为模式挖掘算法研究[D].湖南大学,软件工程,2012,硕士.
[11]李薇,李宛洲.基于数据仓库技术的进销存系统的设计与实现[J].计算机工程与应用,2001,10:93-95+126.
[12]李丹丹.长沙历史风貌区街道色彩的空间结构分析[D].湖南师范大学,设计艺术学,2014,硕士.
[13]李志民,宋连生.1985～1995年乌鲁木齐铁路局车辆伤害事故剖析及对策[J].中国铁路.1997(08)
[14]黄莉娟.西北高校基层管理人员工作效能研究[D].兰州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[15]向左良,白周京,白海钦.高温模压炭砖的研制[J].炭素技术,2012,01:13-16.
[16]曹扬.降脂中药黄连活性成分调节肝脏CYP7A1的作用机制研究[D].广东药学院,中药学,2012,硕士.
[17]孙潇梦.中国横吹笛形制的历史变异考略[D].中国音乐学院,音乐学,2014,硕士.
[18]汤伯敏,梁建,杨德水,林光武,张二路.塑料温室内的雾滴沉积分布研究[J].农业机械学报.2004(03)
[19]詹碧翠.急性白血病CD47的表达及其临床意义研究[D].浙江大学,内科学,2013,硕士.
[20]顾赛麒1,丁玉庭1,王锡昌2,姜文梦2,张晶晶2.电子舌在中华绒鳌蟹产地鉴别及等级评定上的应用[J].食品科学.
[21]韩阳芳.数码喷墨用UV固化油墨[D].东华大学,环境工程,2004,硕士.
[22]王欣欣.“90后”大学生思想政治教育面临的问题及对策研究[D].天津商业大学,思想政治教育,2013,硕士.
[23]王琪.中国银行吉林省分行个人理财产品发展策略研究[D].吉林大学,工商管理,2014,硕士.
[24]刘昌国,李涛,彭轼,曹瑜,高辉.油田分析化验系统的研究与应用[J].石油地球物理勘探,2008,S1:176-181+196.
[25]宋晨晨,叶蜀君.理财产品市场金融消费者保护的制度设置[J].经济问题,2014,06:69-72+88.
[26]贾世庆.供应链金融创新模式研究[D].天津商业大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[27]张丽莉.廊坊市区大众篮球运动开展现状调查及影响因素分析[D].河北师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[28]朱小琴.个性化电影推荐系统的研究与实现[D].华侨大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[29]黄蓉.头发中甲基苯丙胺和氯胺酮毒品的分析方法研究[D].北京化工大学,化学,2013,硕士.
[30]余游,唐鸣.提高炉窑微机自控系统投资效益的探讨[J].冶金自动化,1989,06:26-29+39.
[31]张全禹.基于FPGA的脉象检测系统设计[D].黑龙江大学,电路与系统,2013,硕士.
[32]刘聪.基于神经网络模型的并购协同效应评估[D].北京交通大学,资产评估（专业学位）,2013,硕士.
[33]柴宗盛《东方早报·上海经济评论》记者.科技创业要先有造血能力[N].东方早报,2015-05-05007.
[34]张妙静,张波,刘继宏,厉光烈.贫金属星的表面丰度与慢中子俘获过程[J].高能物理与核物理,2003,04:304-308.
[35]翟玉.防感喷雾剂质量标准和稳定性的进一步研究[D].云南中医学院,中药学,2012,硕士.
[36]周建国.民事审前准备程序之探讨[D].湖南师范大学,法学理论,2004,硕士.
[37]顾晓芳.我国上市公司股票期权激励计划公告前的盈余管理研究[D].浙江大学,会计学,2013,硕士.
[38]李文杰.小学信息技术教材比较研究[D].华中师范大学,现代教育技术,2014,硕士.
[39]刘春艳.直接甲酸燃料电池催化剂载体的研究[D].南京师范大学,2011.
[40]孙衎衎.日用陶瓷产品设计的情感表达研究[D].沈阳理工大学,设计艺术学,2012,硕士.
[41]洪晓韵.建设面向知识管理信息系统的实例介绍[J].情报杂志,2004,07:19-20.
[42]李亚津.跨区域水权交易法律问题研究[D].兰州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[43]李想.论我国警察出庭作证制度的完善[D].安徽大学,法律,2014,硕士.
[44]胡正平,孟鹏权.全局孤立性和局部同质性图表示的随机游走显著目标检测算法[J].自动化学报,2011,10:1279-1284.
[45]吴兰.从神话传说探讨克木人的传统生育观[D].中央民族大学,中国少数民族语言文学,2004,硕士.
[46]苏行.电子软起动器的研究[D].浙江大学,电力电子与电力传动,2004,硕士.
[47]刘苗苗.CIK细胞对结肠癌移植瘤小鼠HIF-1a、T细胞亚群影响研究[D].河北医科大学,肿瘤学,2013,硕士.
[48]陆敏.名人代言虚假广告的民事责任研究[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[49]张紫琼,叶强,李一军.互联网商品评论情感分析研究综述[J].管理科学学报,2010,06:84-96.
[50]刘晓冬,徐景祯.区带油气资源量计算的解析概率法及其在柴达木盆地北缘的应用[J].石油地球物理勘探,2002,04:395-400+422-432.