斑马鱼模型用于沙门菌质粒毒力基因spv对感染及自噬影响的研究

【摘要】目的：幼年斑马鱼通体透明，用荧光菌感染后可在荧光显微镜下动态追踪细菌的分布与播散，是研究病原菌与宿主相互作用的理想模式生物。为研究鼠伤寒沙门菌（Salmonellaentericaserovartyphimurium，S.typhimurium，STM）感染后对斑马鱼自噬的影响，本研究第一部分构建沙门菌-斑马鱼感染模型。为研究沙门菌质粒毒力基因（Salmonellaplasmidvirulencegenes，spv）增强宿主菌毒力的分子机制，第二部分以携带spv基因的鼠伤寒沙门菌野生株STM-WT和spv基因缺失突变株STM-Δspv感染斑马鱼，探讨该基因对斑马鱼体内感染及自噬的影响，为进一步阐明沙门菌质粒毒力基因的致病机制、防治沙门菌感染及新药靶位的发现提供理论和实验依据。方法：1.沙门菌-斑马鱼感染模型的构建及用于自噬的研究(1)沙门菌-斑马鱼感染模型适宜菌量的确定不同浓度鼠伤寒沙门菌UF110浸染受精后72h（hourspost-fertilization，hpf）的幼年斑马鱼，统计斑马鱼7d内的死亡数目并绘制存活率曲线以确定适宜的细菌感染量。(2)沙门菌在斑马鱼体内的播散繁殖以绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）标记的鼠伤寒沙门菌UF110感染72hpf幼年斑马鱼，荧光显微镜下观察细菌在体内的播散。分别收集感染后6、8、10、12、14、16和24h的斑马鱼进行阿米卡星（Amikacin，AMK）杀菌实验。计数整条鱼感染的细菌量和侵入斑马鱼细胞内的细菌量，检测细菌在体内的繁殖情况。(3)鼠伤寒沙门菌对斑马鱼感染模型自噬的影响收集感染后6、8、10、12和14h的斑马鱼，蛋白免疫印迹（western-blotting，WB）检测自噬标志蛋白—微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（microtubule-associatedprotein1lightchain3-Ⅱ，Lc3-Ⅱ）及自噬底物蛋白p62的表达；透射电镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）观察斑马鱼小肠上皮细胞的超微结构。(4)Torin1及氯喹（chloroquine，CQ）对沙门菌-斑马鱼感染模型自噬的影响为探讨自噬激动剂Torin1和溶酶体抑制剂CQ对斑马鱼感染模型的作用，本研究首先测定药物对细菌生长曲线及斑马鱼存活率的影响，并用WB检测自噬相关蛋白的表达以确定Torin1及CQ的适宜工作浓度。分别以适宜浓度的Torin1和CQ单独及共同预处理斑马鱼后与受试菌共培养，收集感染后的斑马鱼进行细菌计数，WB检测Lc3-Ⅱ和p62的表达。2.斑马鱼模型用于沙门菌质粒毒力基因spv对感染及自噬影响的研究(1)红色荧光菌的构建在绿色激发光下斑马鱼卵黄囊背景较强难以辨认，为降低背景光的干扰，首先构建背景干扰较小的红色荧光菌。将表达红色荧光蛋白（redfluorescentprotein，RFP）的质粒pGMDs3用CaCl2转化法分别导入携带spv基因的野生株STM-WT和spv基因缺失突变株STM-Δspv，荧光显微镜鉴定后，活体成像仪观察细菌发光情况，确定荧光强度与细菌数量的关系，并检测RFP对细菌生长曲线的影响。(2)沙门菌质粒毒力基因spv对斑马鱼半数致死量LD50的影响用不同浓度STM-WT和STM-Δspv感染斑马鱼后，统计斑马鱼7d内的死亡数目，用Reed-Muench法计算受试菌对斑马鱼的LD50。(3)沙门菌质粒毒力基因spv对细菌在斑马鱼体内繁殖播散的影响将STM-WT和STM-Δspv分别感染斑马鱼不同时间后，荧光显微镜下比较受试菌在体内的播散。收集感染后4、8、12、16和24h的斑马鱼进行AMK杀菌实验，比较两株菌感染整条鱼的细菌量及侵入斑马鱼细胞内菌量的差异。(4)沙门菌质粒毒力基因spv对斑马鱼感染模型自噬的影响将STM-WT和STM-Δspv分别感染斑马鱼不同时间后，WB检测自噬标志蛋白Lc3-Ⅱ和自噬底物蛋白p62的表达；Torin1和CQ单独预处理斑马鱼24h后，分别与两株受试菌共作用8h，WB检测干预后Lc3-Ⅱ和p62的表达并计数药物干预后细胞内活菌数。结果：1.沙门菌-斑马鱼感染模型的构建及对自噬的研究(1)沙门菌-斑马鱼感染模型适宜菌量的确定：109cfu/ml细菌量感染斑马鱼后，两天内对其无显著影响，感染后3d出现尾巴卷曲、游动时协调性和灵活能力下降的情况,并出现死亡现象。依据研究目的，自噬是发生在感染早期的事件，选择感染后两天内对斑马鱼存活无显著影响的109cfu/ml为后续实验用菌量。(2)沙门菌在斑马鱼体内的播散繁殖：荧光显微镜下发现，感染后4h（hourspostinfection，hpi）斑马鱼口周及卵黄囊中均有细菌侵入，8hpi斑马鱼肠道中可检测到细菌信号。此后细菌逐渐播散，1d后眼睛周围及头部出现绿色荧光信号，2d后播散至斑马鱼整个头部，3d后遍布全身。细菌计数结果显示，未加AMK组整条鱼感染的细菌量随时间进行而增加，10hpi感染的细菌量显著高于8hpi感染菌量(p<0.001)；加入AMK杀死胞外菌后，细菌量明显降低，且10hpi鱼体中侵入细胞内的细菌量显著低于8hpi胞内菌量(p<0.001)。(3)鼠伤寒沙门菌对斑马鱼感染模型自噬的影响：WB结果显示，细菌感染斑马鱼8h后，自噬标志蛋白Lc3-Ⅱ的表达显著高于对照组及其余时间点(p<0.001)，自噬底物蛋白p62的表达则显著降低(p<0.01)；10hpi上述趋势仍存在(p<0.05)。TEM结果显示，8hpi幼鱼肠道可观察到肿胀的线粒体结构，同时还见包裹着细菌的双层膜自噬体结构和降解内容物的单层膜溶酶体结构。(4)Torin1和CQ对沙门菌-斑马鱼感染模型自噬的影响：0.4μmol/LTorin1作用斑马鱼24h后，斑马鱼存活率为100%，Lc3-Ⅱ表达水平最高(p<0.001)；50μmol/LCQ作用斑马鱼24h后，斑马鱼未出现死亡，且p62表达水平显著增高(p<0.01)。细菌计数结果显示，Torin1处理组细菌数目显著降低(p<0.01)，而CQ处理组(p<0.05)和两种药物共处理组(p<0.001)细菌数目均增加。WB结果表明，与正常感染组相比，Torin1处理组Lc3-Ⅱ表达水平显著升高(p<0.01)，p62表达水平显著降低(p<0.01)；CQ处理组(p<0.01)与两种药物共处理组(p<0.001)，Lc3-Ⅱ与p62表达水平均显著增加。2.斑马鱼感染模型用于沙门菌质粒毒力基因spv对感染及自噬影响的研究(1)红色荧光菌的构建：在荧光显微镜下可观察到红色杆状细菌，其荧光强度与细菌数量呈线性正相关；红色荧光蛋白RFP对细菌24h内生长曲线未见显著影响。(2)沙门菌质粒毒力基因spv对斑马鱼半数致死量LD50的影响：野生株STM-WT的LD50为1.17×107cfu/ml，突变株STM-Δspv的LD50为1.95×108cfu/ml，说明spv能显著降低宿主菌对斑马鱼的LD50。(3)沙门菌质粒毒力基因spv对细菌在斑马鱼体内繁殖播散的影响荧光显微镜检测结果显示，感染后4~6h，野生株STM-WT和突变株STM-Δspv感染组斑马鱼口周均可检测到发光菌；8h后两组斑马鱼肠道中均可检测到红色荧光菌，且STM-WT感染组荧光强度高于STM-Δspv感染组。随着感染时间的延长，STM-WT在斑马鱼体内的繁殖和扩散速度较快，2d已播散至全身；而STM-Δspv繁殖和扩散程度较慢，直至3d播散至全身。细菌计数结果显示，STM-WT感染组整条鱼感染的细菌量在同一感染时间点显著高于STM-Δspv感染组（p<0.05，p<0.01）；加入AMK杀死胞外菌后，细菌量明显降低，但STM-WT感染组侵入鱼体细胞内的细菌量仍显著高于STM-Δspv感染组（p<0.01，p<0.001）。(4)沙门菌质粒毒力基因spv对斑马鱼感染模型自噬的影响WB检测自噬标志蛋白Lc3-Ⅱ和自噬底物蛋白p62结果显示，细菌感染斑马鱼8h后，野生株STM-WT感染组Lc3-Ⅱ表达水平显著低于spv基因缺失突变株STM-Δspv感染组（p<0.01），而p62表达水平显著升高（p<0.01）。10h依然保持上述趋势（Lc3-Ⅱ，p<0.01；p62，p<0.05），但6h未见明显差异（p>0.05）。Torin1干预后，STM-WT感染组Lc3-Ⅱ水平提高（p<0.05），但与STM-Δspv感染组间无显著差异（p>0.05）；CQ干预后，各组Lc3-Ⅱ水平均有所提高（p<0.01），且STM-WT感染组仍低于STM-Δspv感染组（p<0.01）；各组p62水平也显著增高（p<0.01），但各感染组间无显著差异（p>0.05）。细菌计数结果显示，感染8h后，STM-WT感染组胞内CFU显著高于STM-Δspv感染组（p<0.01）；Torin1干预后，两组胞内CFU均有减少，且两组间差异减小（p<0.05）；CQ干预后，两组胞内CFU无显著差异（p>0.05）。结论：1.成功构建了可用于研究自噬的沙门菌-斑马鱼感染模型。2.自噬具有保守性，Torin1和CQ对斑马鱼自噬的影响与对哺乳动物细胞自噬的影响相似。3.沙门菌质粒毒力基因spv可增强鼠伤寒沙门菌对斑马鱼的毒力，促进宿主菌在体内的繁殖和播散，从而加重感染。spv对鼠伤寒沙门菌所致的斑马鱼异源自噬具有抑制作用，CQ干预结果显示，其作用时相早于溶酶体降解过程，在早期自噬体形成阶段。
【作者】李金玲；
【导师】黄瑞；
【作者基本信息】苏州大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】斑马鱼；鼠伤寒沙门菌；spv；自噬；

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