TRIM29逆转P53突变型结肠癌奥沙利铂耐药及其机制的研究

【摘要】第一部分pIRES2-ZsGreen1-TRIM29载体构建目的：构建pIRES2-ZsGreen1-TRIM29质粒表达载体方法：以pDONR223-TRIM29为基因模板,PCR扩增TRIM29CDS区片段,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,并回收TRIM29条带。用BglⅡ、EcoRI将回收的TRIM29的PCR片段及目的载体pIRES2-ZsGreenl双酶切,然后进行连接。将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α中进行扩增,挑选kan+阳性克隆菌落,进行小规模质粒提取。将提取的质粒进行酶切鉴定及DNA测序鉴定。结果：1、将TRIM29的PCR产物进行电泳,条带大小在1.8K左右,结果与预期结果一致。2、用BglⅡEcoRI双酶切重组质粒,切出约1.8K左右的TRIM29片段带和约5.3kb左右的载体条带。结果与预期一致。3、将重组质粒进行DNA测序,将测序所得的序列和TRIM29基因片段序列进行比对,显示构建序列与预期序列完全一致,pIRES2-ZsGreen1-TRIM29质粒表达载体构建成功。结论：成功构建pIRES2-ZsGreen1-TRIM29表达质粒。第二部分TRIM29大幅提高P53突变型结肠癌细胞HT29对奥沙利铂的敏感性目的：探索在不同p53状态下,TRIM29对结肠癌细胞奥沙利铂敏感性的影响方法：选取P53野生型结肠癌细胞HCT116和P53突变型结肠癌细胞HT29(R273H附录1)进行对照研究。利用MTT方法分别测定转染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29质粒前后,两株细胞生长速度的变化和奥沙利铂IC50的变化。结果：1、转染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29质粒后,HCT116和HT29两株细胞TRIM29的mRNA和蛋白质表达水平均上升,提示转染成功。2、转染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29质粒后,HCT116从第4天开始生长明显加快,到第7天时,转染组的细胞数约为亲代组细胞数的1.4倍。而HT29从第3天起生长速度比亲代细胞减慢,第7天时,转染组的细胞数约为亲代组细胞数的73%。3、转染pIRES2-ZsGreen1-TRIM29质粒后,HCT116的奥沙利铂IC50从34.89umol/L提高到47.26umol/L,耐药指数1.35,轻度降低了HCT116对奥沙利铂的敏感性；而HT29的奥沙利铂IC50从11.54umol/L降至0.98umol/L,耐药指数0.08,显著提高了HT29对奥沙利铂的敏感性。结论：1、在结肠癌中,TRIM29对表达野生型P53的细胞,表现为促进肿瘤生长作用；而对表达突变型P53的细胞,表现为抑制肿瘤生长的作用。2、在野生型P53结肠癌细胞HCT116中,TRIM29阻断P53功能能够增加细胞对奥沙利铂的耐药,但不显著。提示野生型P53与奥沙利铂敏感性轻度相关。3、在突变型P53结肠癌细胞HT29中,TRIM29能够大幅提高HT29对奥沙利铂的敏感性。提示TRIM29可能通过结合组阻断突变型P53功能来提高HT29对于奥沙利铂的敏感性,突变型P53与奥沙利铂耐药高度相关。第三部分HT29-OX耐药细胞模型的构建目的：构建P53突变型结肠癌细胞HT29耐奥沙利铂模型方法：利用低浓度持续培养法构建HT29结肠癌耐奥沙利铂细胞模型。首先在奥沙利铂浓度为4umol/L(1/3IC50)时培养HT29细胞2-4个星期,直到细胞出现成倍数增长时,再在4umol/L继续培养2个星期,传代。将奥沙利铂浓度提高至6umol/L。按此循环,将奥沙利铂的浓度逐步提高直至12umol/L(4umol/L-6umom/L-8umol/L-10umol/L-12umol/L)。结果：1、成功获得能够在奥沙利铂浓度为4umol/L,8umol/L和12umol/L时,稳定生长的三株耐药细胞模型,分别命名为HT29-OX-4umol/L,HT29-OX-8umol/L,HT29-OX-12umol/L.2、三株耐药细胞模型奥沙利铂IC50分别为74.42umol/L,136.50umol/L188.90umol/L,耐药指数分别为6.47,11.90,16.37。3、随着耐药浓度的增加,三株耐药细胞中MDR1的表达逐渐增加(其中HT29-OX-12umol/LmRNA水平上升至亲代的4.3倍,蛋白质水平上升至亲代的2倍)。结论：成功建立HT29-OX-4umol/L,HT29-OX-8umol/L,HT29-OX-12umol/L三株耐药细胞模型。为下一步研究TRIM29在突变型P53结肠癌耐奥沙利铂中的作用及其机制奠定了基础。第四部分TRIM29逆转HT29-OX耐药细胞模型对奥沙利铂的耐药及其机制探讨目的：进一步验证TRIM29能否逆转HT29-OX耐药细胞模型对奥沙利铂的耐药及其可能的机制。方法：利用MTT方法测定转染pIRES2-ZsGreenl-TRIM29质粒前后,HT29-OX-12umol/L细胞奥沙利铂IC50的变化。利用免疫共沉淀的方法检测P53突变型结肠癌细胞HT29内TRIM29和突变型P53蛋白之间的相互作用。利用实时荧光定量PCR和westernblot方法,检测随耐药浓度的增加,三株耐药细胞模型中TRIM29,P53的表达变化情况。检测T29-OX-12umol/L细胞转染pIRES2-ZsGreenl-TRIM29质粒后,P53和MDR1表达的变化。结果：1、HT29-OX-12umol/L耐药细胞转染pIRES2-ZsGreenl-TRIM29质粒后,奥沙利铂IC50从188.90umol/L下降至22.59umol/L,耐药株指数从16.37下降至1.96。成功逆转结肠癌耐药模型对奥沙利铂的耐药。2、在P53突变型结肠癌细胞HT29中TRIM29和突变型P53蛋白相互结合。3、随着耐药浓度的增加,TRIM29表达逐渐下降(其中HT29-OX-12umol/LmRNA水平下降至亲代的23%,蛋白质水平下降至亲代的41%),P53表达逐渐增高(其中HT29-OX-12umol/LmRNA水平上升至亲代的5.1倍,蛋白质水平上升至亲代的1.8倍)。4、转染pIRES2-ZsGreenl-TRIM29质粒后,在HT29-OX-12umol/L耐药细胞中,MDR1表达明显下降(MDR1mRNA表达水平下降至耐药细胞的24%,蛋白质表达水平下降至耐药细胞的43%)；P53表达无明显改变。结论：1、TRIM29并非从转录水平阻止突变型P53的功能,其发挥作用的方式,主要是通过与突变型P53物理结合来阻止突变型P53的生物功能。2、TRIM29在胞浆内结合突变型P53蛋白,将突变型P53锚定与胞浆中,阻止了突变型P53下游基因MDR1的表达,从而逆转了结肠癌耐奥沙利铂细胞株对奥沙利铂的耐药。
【作者】何超；
【导师】齐海智；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】TRIM29；质粒表达载体构建；HT29；HCT116；奥沙利铂；P53突变；耐药细胞模型；MDR1；免疫共沉淀；

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