PRDM基因启动子甲基化在非小细胞肺癌中的作用研究

【摘要】研究背景：非小细胞肺癌(NSCLC)是危害人类健康的最主要恶性肿瘤,发病机制与基因启动子甲基化(简称甲基化)状态异常导致基因表达失常密切相关。PR区锌指蛋白(PRDM)具有组蛋白甲基转移酶活性和抑制性转录调节功能,参与调节细胞分化、器官发育等生命活动,是近年备受关注的肿瘤抑制蛋白家族。PRDM基因甲基化广泛参与肿瘤的发病机制,但是与肺癌的相关性研究报道非常罕见。研究目的：研究PRDM家族基因甲基化是否参与NSCLC的发病机制,明确NSCLC的PRDM家族基因甲基化模式。研究方法：1临床标本研究部分：收集52例肺鳞癌和23例肺腺癌患者的原发肿瘤组织(简称肿瘤组织)、癌旁组织和远处对照肺组织(简称远处肺组织)标本；通过采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测PRDM家族基因的mRNA表达水平,筛选出肿瘤组织中表达缺失或降低的PRDM家族成员(简称肺癌相关PRDM)；然后采用甲基化特异性多聚合酶链反应(MSP)检测肿瘤组织、癌旁组织和远处肺组织肺癌相关PRDM基因的甲基化状态,免疫组织化学染色和Western-blot方法检测肺癌相关PRDM基因的蛋白质表达水平；分析甲基化状态对mRNA和蛋白质表达水平的影响；分析肿瘤组织肺癌相关PRDM基因甲基化状态与患者临床特征的相关性。2肿瘤细胞系研究部分：体外培养人肺鳞癌HTB-182细胞、人肺腺癌A549细胞、永生化人支气管上皮HBE细胞,分别用0μmol/L(对照组)、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2dC)进行处理,MTT实验检测细胞生长曲线,MSP检测PRDM2、PRDM5、PRDM16基因启动子甲基化状态,RT-PCR和Western-blot方法检测PRDM2、PRDM5、PRDM16基因mRNA和蛋白质表达水平。3移植瘤研究部分：体外培养人肺鳞癌SK-MES-1细胞,MSP检测PRDM5基因甲基化状态,然后用不同浓度的5-aza-2dC对SK-MES-1细胞进行去甲基化处理,MTT实验检测细胞增殖情况。22只雄性BALB/c裸鼠随机分为对照组和5-aza-2dC治疗组,每组11只,皮下接种SK-MES-1细胞,待移植瘤短径达0.5cm时,治疗组施以5-aza-2dC腹腔注射治疗,对照组行磷酸盐缓冲液腹腔注射对照处理,观察肿瘤生长情况。4周后取出移植瘤称重,利用MSP.RT-PCR、Westem-blot方法分别检测PRDM5基因甲基化状态及mRNA和蛋白表达水平。研究结果：1临床标本研究部分：(1)PRDM1、PRDM2、PRDM5、PRDM6、PRDM10、PRDM14、PRDM15、PRDM16基因在肺鳞癌和肺腺癌的肿瘤组织、癌旁组织和远处肺组织均有mRNA表达,其中PRDM2mRNA.PRDM5mRNA.PRDM16mRNA在肿瘤组织表达降低或缺失。(2)肺鳞癌患者肿瘤组织、癌旁组织、远处对照组织PRDM2基因甲基化频率分别为67.3%、50.0%、17.3%,PRDM5基因甲基化频率分别为73.1%、44.2%、21.1%,PRDM16基因甲基化频率分别为80.8%、40.4%、21.2%；肺腺癌患者肿瘤组织、癌旁组织、远处对照组织PRDM2基因甲基化频率分别为,78.3%、34.8%、21.7%,PRDM5基因甲基化频率分别为82.6%、47.8%、17.4%,PRDM16基因甲基化频率分别为82.6%、52.2%、30.4%；肿瘤组织甲基化频率显著高于远处对照组织,癌旁组织介于肿瘤组织和远处对照组织之间。(3)肺鳞癌和肺腺癌患者癌旁组织PRDM2、PRDM5、PRDM16蛋白质表达水平高于肿瘤组织,远处肺组织PRDM2、PRDM5、PRDM16蛋白质表达水平高于癌旁组织。(4)在所有组织标本中,PRDM2、PRDM5、PRDM16基因完全甲基化的标本均未能检测到mRNA和蛋白质；按照肺鳞癌、肺腺癌以及肿瘤组织、癌旁组织、远处肺组织将标本分为6个亚组,每个亚组内PRDM2、PRDM5、PRDM16基因部分甲基化标本的nRNA和蛋白质表达水平均低于未甲基化标本。(5)肿瘤组织PRDM2、PRDM5、PRDM16基因甲基化与肺癌患者临床病理特征相关性分析结果显示：PRDM2和PRDM16基因甲基化与肺鳞癌患者是否吸烟相关,吸烟者甲基化比例更高；PRDM5基因甲基化状态与肺鳞癌患者肿瘤分化程度相关,低分化鳞癌甲基化比例更高。2肿瘤细胞系研究部分：(1)5-aza-2dC处理对A549和HTB-182和HBE细胞都表现出生长抑制效应,但是对A549和HTB-182细胞的生长抑制效应强于HBE细胞。(2)对照组HBE细胞PRDM2、PRDM5、PRDM16基因存在低度甲基化,5-aza-2dC处理对以上3个基因的甲基化状态及mRNA和蛋白质表达水平无明显影响。(3)对照组HTB-182和A549细胞PRDM2、PRDM5、PRDM16基因处于高甲基化状态,5-aza-2dC处理能够浓度依赖性地逆转PRDM2、PRDM5、PRDM16基因的甲基化状态,并上调mRNA和蛋白质表达水平,HTB-182细胞对5-aza-2dC处理的敏感性强于A549细胞。3移植瘤研究部分：(1)SK-MES-1细胞PRDM5基因存在甲基化。(2)5-aza-2dC处理对SK-MES-1细胞具有生长抑制效应。(3)裸鼠经皮下接种SK-MES-1细胞后于第5～9d开始成瘤,成瘤率100%。5-aza-2dC治疗组裸鼠移植瘤的生长速度低于对照组,荷瘤结束时治疗组移植瘤重量(0.86±0.42g)显著低于对照组(2.03±0.63g)。(4)对照组11个移植瘤中8个检测到PRDM5基因甲基化,5-aza-2dC治疗组11个移植瘤中仅3个检测到PRDM5基因甲基化。(5)5-aza-2dC治疗组裸鼠移植瘤组织PRDM5mRNA及蛋白质表达水平相对强度分别为0.52±0.10和0.52±0.18,对照组裸鼠移植瘤组织PRDM5mRNA及蛋白质表达水平相对强度分别为0.16±0.11和0.15±0.10,治疗组mRNA及蛋白质表达水平均高于对照组。研究结论：(1)非小细胞肺癌组织PRDM2、PRDM5、PRDM16表达缺失或降低。(2)基因甲基化是导致非小细胞肺癌组织PRDM2、PRDM5、PRDM16基因表达缺失或降低的主要原因。(3)吸烟可能是导致非小细胞肺癌组织PRDM2、PRDM16甲基化的重要原因。(4)去甲基化药物对非小细胞肺癌具有生长抑制作用,其机制可能与改变PRDM2、PRDM5、PRDM16等基因的甲基化状态有关。图15幅,表19个,参考文献98篇
【作者】谭双香；
【导师】刘文恩；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】肺肿瘤；PR区锌指蛋白；表观遗传学；甲基化；基因表达；

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