杜仲皮有效成分与其内生真菌的相关性研究

【摘要】目的通过采集几个代表性产地的杜仲树皮,比较其内生真菌的种群结构差异；研究不同季节杜仲皮内生真菌的种群结构及其与外部环境因子的相关性；构建不同产地杜仲皮的HPLC/Q-TOF-MS指纹图谱,比较不同产地、不同季节杜仲皮中成分及含量的差异性,分析不同季节有效成分的动态积累变化,并分析这种差异与杜仲皮组织中内生真菌种群之间的相关性；同时,分析代表性内生菌株发酵产物中化学成分,将其与杜仲皮中化学成分进行比较,为探索杜仲皮内生真菌与宿主之间相互作用关系提供了一定的思路及线索。方法(1)采用平板分离法分离来自慈利、略阳和遵义三个产地的杜仲干皮内生真菌,通过形态和分子手段相结合的方式对分离出的真菌进行鉴定,统计不同产地杜仲皮内生真菌菌株数,并计算其多样性指数及相似度,采用ClustalX1.81进行多重序列对比,再利用MEGA5.1软件进行系统发育分析,构建邻接树。同时,采用Kimura2-parametermodel对同属的序列构建遗传距离矩阵。(2)采用与不同产地内生真菌研究相同的方法,对不同季节杜仲皮内生真菌进行分离及鉴定,统计不同季节内生真菌菌株及种群数,计算不同季节内生真菌的多样性及相似度,并运用Canoco生态学统计软件,对不同季节内生真菌的种群结构与其气候因子的相关性进行分析。(3)采用HPLC/Q-TOF-MS技术建立不同产地杜仲皮HPLC/Q-TOF-MS液质联用指纹图谱,运用SPSS软件进行聚类分析,寻找不同产地的差异。(4)应用HPLC/Q-TOF-MS方法,对采集的不同产地及不同季节杜仲药材进行含量测定,运用SPSS16.0统计软件,以各菌属的相对频率为自变量,PDG、Au或GPA的含量为应变量,将杜仲皮中有效成分与其内生真菌种群结构进行相关与回归分析,评估杜仲皮内生真菌与宿主有效成分之间的关系。(5)采用HPLC/Q-TOF-MS技术对分离得到的代表性内生菌株发酵产物进行检测,并与杜仲样品进行对比,寻找相同或相似代谢产物。结果(1)从三个产地杜仲皮中共分离得到152株内生真菌,分属于8个属,其中Phomopsis、Diaporthe、Alternaria为三个产地内生真菌共有属,各产地的优势种群不同。相似性分析表明,不同产地杜仲皮内生真菌的组成结构上存在差异；多样性及均匀度分析表明,慈利和略阳产地杜仲皮内生真菌种群多样性较高,分布较均匀。遵义产地杜仲皮内生真菌种群的多样性指数及均匀度指数最低,优势种群集中,奇异度较高。拟茎点菌属与其有性态间座壳属菌株的系统发育及遗传距离分析,不同产地杜仲皮中拟茎点菌属及其有性态真菌多样性丰富。(2)多样性分析结果表明,11月和1月的杜仲皮内生真菌种群多样性丰富,分布较均匀,而3月和7月杜仲皮中内生真菌优势菌群集中,奇异度较高,种群较单一。影响杜仲皮内生真菌季节差异的重要气候因子为最小相对湿度、降水量、平均相对湿度,不同种属内生真菌受气候因子影响存在较大差异。(3)不同产地的15批药材有22个共有峰,通过数据比对及质谱分析,鉴定14个特征峰,对指纹图谱的聚类分析结果显示云南和四川产杜仲皮与其他产地之间差异性较大。(4)不同产地5种主要有效成分含量差异较大,略阳产地和慈利产地质量较优。季节变化的规律显示,3、5月份杜仲皮中有效成分含量较高,质量较佳。内生真菌种群结构与宿主杜仲皮中有效成分的相关与回归分析表明,拟茎点菌属和间座壳属内生真菌与5种有效成分含量密切相关,正负影响因成分的不同而有所差异。(5)从五种杜仲皮内生真菌的发酵产物及杜仲样品的总离子流图与紫外图的对比上,发现4处共有峰,但通过质谱分析,未找到内生菌株发酵产物与杜仲皮提取物中相同的化学成分,还有待进一步的研究。结论杜仲皮组织中的内生真菌具有多样性,不同产地及不同季节内生真菌的数量、组成及种群间存在显著差异；影响不同季节杜仲皮中内生真菌种群差异的主导气候因子为最小相对湿度、降水量、平均相对湿度；不同产地杜仲皮中的化学成分组成及含量存在差异,主要有效成分含量的差异性与杜仲皮的内生真菌密切相关,其中拟茎点菌属和间座壳属的真菌对杜仲皮中有效成分影响较大；对五种杜仲皮内生真菌发酵产物检测未发现与杜仲皮中相同的化学成分,推测内生真菌对宿主化学成分为间接影响,二者互作机制有待进一步研究。
【作者】梁雪娟；
【导师】张水寒；
【作者基本信息】湖南中医药大学，中药学，2014，硕士
【关键词】杜仲皮；产地；季节；内生真菌；气候因子；HPLC/Q-TOF-MS；有效成分；发酵产物；

【参考文献】
[1]朱忠隆,刘武君.城市轨道交通项目运营管理的企业模式分析[J].城市轨道交通研究.2007(08)
[2]徐卫青.强关联离子体系双激发态的精细谱学研究[D].中国科学技术大学,原子与分子物理,2014,博士.
[3]卜禾.关于“钢水测温仪显示器的改进研究”一文的意见[J].冶金自动化,1988,01:63.
[4]黄挚雄.中药生产过程优化控制策略的研究[D].中南大学,2006.
[5]李敬.服务型政府视域下的公务员职业道德建设[D].内蒙古科技大学,思想政治教育,2013,硕士.
[6]钟诗胜,王体春,丁刚.基于多指标灰区间数关联决策模型的产品方案设计[J].控制与决策,2008,12:1378-1382+1394.
[7]李先斌.应用多维尺度分析等方法进行H5N1禽流感病毒进化与传播机制研究[D].中国科学院深圳先进技术研究院,计算机应用技术,2014,硕士.
[8]钱海霞.AKULA-T：多核环境下评估和开发温度感知线程放置算法的框架[D].内蒙古大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[9]潘郁.基于敏感性分析的大跨空间网格结构传感器布置研究[D].浙江大学,2014.
[10]肖英龙,刘成镛.硅钢合成渣脱硫及对新渣的展望[J].四川冶金.1988(03)
[11]曹渊钧.高动态范围图像压缩方法研究及其读取器的实现[D].湖南大学,软件工程,2013,硕士.
[12]于蓉蓉.蜡蚧轮枝菌（Verticillium lecanii）分生孢子萌发及储藏期存活的影响因素初步研究[D].中国农业大学,农业昆虫与害虫防治,2004,硕士.
[13]王亚卓.工程项目团队内外部冲突问题研究[D].吉林大学,项目管理,2014,硕士.
[14]张钦,王锡凡,王秀丽,王建学.需求侧实时电价下用户购电风险决策[J].电力系统自动化,2008,13:16-20+66.
[15]曹丽军.没食子酸基环氧树脂的合成及其在纳米复合材料中的应用[D].河北大学,2013.
[16]高亚丽.矿用磨机回转体性能分析及测试研究[D].河南科技大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[17]欧阳如东.基于汽车销售预测模型的比较研究[D].景德镇陶瓷学院,概率论与数理统计,2014,硕士.
[18]赵玉柱.直线一级倒立摆的摩擦补偿及自适应控制研究[D].河南科技大学,控制理论与控制工程,2012,硕士.
[19]李琰.民航青岛空中交通管理站服务质量提升问题研究[D].安徽大学,工商管理,2013,硕士.
[20]蒋仕菁.特教大学生感受到的社会偏见与自我价值感、应对方式的关系研究[D].西南大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[21].2013年杭州市科技进步奖获奖名单[J].杭州科技,2014,01:20-21.
[22]刘剑锋.论我国企业信用制度的建立和完善[D].吉林大学,国民经济学,2004,硕士.
[23]金惠.简述人体生物标本的法律监管[D].上海社会科学院,国际法学,2012,硕士.
[24]张唯.成都恒知教育公司营销模式分析[D].四川大学,工商管理,2003,硕士.
[25]安成林.人的需要理论与大学生思想政治教育方法的优化[D].青海师范大学,思想政治教育,2012,硕士.
[26]王春晖.肠出血型大肠埃希菌O157:H7 EspF蛋白诱导细胞凋亡功能研究[D].南方医科大学,病原生物学,2012,硕士.
[27]李振海.临沂市万兴都商业地产项目策划运营研究[D].西安科技大学,工商管理,2013,硕士.
[28]袁晓琳.大运河遗产旅游地社区化服务开发取向研究[D].河北师范大学,人文地理学,2014,硕士.
[29]贾金荣.六盘山连片特困地区自我发展能力研究[D].兰州大学,区域经济学,2013,硕士.
[30]刘洁.河北省临港产业与腹地产业演进共生的路径选择研究[D].河北师范大学,政治经济学,2013,硕士.
[31]王航.基于SiC外延石墨烯工艺及Raman表征[D].西安电子科技大学,2012.
[32]杨岚.如何提高《社会保障概论》课程的教学质量[J].中国校外教育.
[33]周珍剑.成都市高星级酒店园林植物景观研究[D].四川农业大学,风景园林（专业学位）,2012,硕士.
[34]纪翔.云计算改善企业信息化问题的实证分析[D].上海外国语大学,企业管理,2012,硕士.
[35]陈晶.新课标背景下初中作文系统性教学研究[D].华中师范大学,教育管理,2014,硕士.
[36]顾芝亚.辛硫磷诱导后家蚕中肠差异表达基因研究[D].苏州大学,细胞生物学,2013,硕士.
[37]朱勇忠.深圳腾飞医药公司发展战略研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[38]张琛琛.溶解性有机质影响下人工合成氧化铜纳米颗粒对蛋白核小球藻的致毒机制[D].中国海洋大学,2013.
[39]杨保军.嵌入式蓝牙信息共享系统的设计与实现[D].西安电子科技大学,微电子学与固体电子学,2012,硕士.
[40]湛鑫琳.金属钴修饰的介孔硅分子筛的制备及其催化性能研究[D].黑龙江大学,无机化学,2013,硕士.
[41]翟金俊.血管内照射对血管成形术后再狭窄大鼠血浆细胞因子影响的实验研究[D].山西医科大学,心血管内科学,2002,硕士.
[42]闻嘉.含有WW结构域的氧化还原酶的基因对人骨肉瘤细胞MG-63的生长抑制的作用及机制[D].郑州大学,骨科,2013,硕士.
[43]邢珍珍.新疆藁本中酪氨酸酶抑制成分的高效液相色谱筛选研究[D].塔里木大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[44]李鹏.BaMoO_4:Eu~(3+)发光材料的合成及性能表征[D].东北大学,物理化学,2010,硕士.
[45]何楚瑶.高频角振动转台控制系统研究[D].中北大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[46]徐洪亮.《铸就实现民族复兴的政治优势》俄译之难点及解决方法[D].黑龙江大学,翻译,2013,硕士.
[47]于永翠.EGSB-A/O组合工艺处理淀粉制糖生产废水的工程优化[D].齐鲁工业大学,轻工技术与工程,2014,硕士.
[48]张丹慧,黄敏,佟振声.基于Agent的分布式入侵检测系统[J].计算机工程与应用,2004,35:160-162+169.
[49]娄宇.一种用于无人机图像传输的π/4-DQPSK调制解调的实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2010,硕士.
[50]任佩剑.长青学院校园网安全解决方案[D].兰州大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.