P物质对体外培养人牙髓细胞生物学特性的影响

【摘要】随着社会的发展，由各种原因导致的牙齿意外露髓逐渐增多，传统盖髓方法效果往往不理想，近年来，越来越多的学者把牙髓生物学研究的重点放到了牙髓细胞上，从细胞水平为临床研究提供实验基础。目的：采用组织块酶解法培养具有干细胞特性的人牙髓细胞，通过观察P物质对体外培养人牙髓细胞的增殖、分化及超微结构的影响，探讨P物质对体外培养人牙髓细胞生物学特性的影响及其作用机制，为临床开展活髓保存治疗提供一条新的思路。方法：1人牙髓细胞的原代培养及组织来源鉴定选取因阻生或正畸需要而拔除的健康、完整、无龋、无隐裂恒牙，清理牙齿表面后于无菌条件下取出牙髓组织，采用组织块酶解法进行原代培养，首次传代选择原位传代，以后待细胞长满孔底80%后按常规传代方法进行传代。取第3代对数生长期细胞用SABC法进行波形蛋白、角蛋白免疫组化染色，光镜下观察；用HE对盖玻片上的细胞进行染色，光镜下观察细胞形态。2人牙髓细胞生长曲线的检测取第3代人牙髓细胞，制成单细胞悬液，以2×104个/孔的密度接种于24孔板，自接种后第二天开始每天随机消化5孔进行细胞计数，取平均值。连续计数8天，绘制细胞生长曲线。3P物质对HDPCs增殖活性的影响选取第4代人牙髓细胞制备成细胞悬液，以2×104个/ml的密度接种于96孔培养板,每孔200微升。24小时后，弃去原培养液，随机分为5个实验组和1个对照组，另设一空白对照组，实验组分别加入用含1%FBS的DMEM配制的五个浓度的P物质（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）；对照组和空白对照组只加含1%FBS的DMEM液，以上7组每孔液量均为200微升。分别于培养第1、2、3、4、5天用CCK-8法测定各孔的吸光度值（A450）。4P物质对HDPCs分化的影响4.1P物质对HDPCs碱性磷酸酶活性的影响实验分组及培养条件同上。分别在药物作用第1、3、5、7天时随机取出一块96孔板，弃培养基，PBS缓冲液冲洗3次，吸干，每孔加入50μl0.1%TritonX-100，4℃冰箱过夜。光镜下观察细胞已无完整结构后，按照碱性磷酸酶试剂盒说明书每孔加入碱性磷酸酶底物100μl，37℃孵育30min，最后以0.2mol/LNaOH50μl终止反应，以空白对照孔调零，在酶标仪上测定410nm波长下各孔的吸光度值（A410）。4.2P物质对HDPCs牙本质涎磷蛋白mRNA的影响取第4代人牙髓细胞，制备成细胞悬液后以104个/ml的浓度接种在25ml培养瓶，每瓶3ml，共6瓶。24小时后将6瓶细胞随机分为3个对照组和3个实验组，对照组每瓶加入含1%FBS的培养液3ml，实验组每瓶加入用含1%FBS的DMEM配制的P物质（10-7mol/L）3ml，于培养第7、14、21天分别随机取出实验组和对照组细胞各1瓶，PBS反复冲洗3遍，加入Trizol1ml反复吹打直至细胞完全裂解，将细胞收集至无酶EP管中，-80℃保存备用。以上实验步骤及分组重复3次。按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，RT-PCR检测DSPPmRNA的表达。5P物质对HDPCs超微结构的影响取第4代人牙髓细胞，制备成细胞悬液后以2×104个/ml的浓度接种在25ml培养瓶，每瓶3ml，共6瓶。24小时后将6个培养瓶随机分为2组，实验组和对照组各3瓶，实验组每瓶加入用含1%FBS的DMEM配制的P物质（10-7mol/L）3ml,对照组每瓶加入含1%FBS的培养液3ml。培养48小时后收集细胞，2.5%戊二醛固定2小时，常规样品制备，透射电镜下观察。6统计学分析采用SPSS13.0统计软件对实验所得数据作单因素方差分析，采用S-N-K法进行多重比较。实验数据以均数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。结果：1体外培养人牙髓细胞的生物学特性采用组织块酶解法可以成功培养出成纤维样细胞，镜下观察细胞胞体丰满，胞质均匀，细胞核为圆形或卵圆形位于细胞中央，核仁清晰可见，其生长曲线呈典型的“S”型，经免疫组化鉴定，所培养的细胞波形蛋白染色均为阳性、角蛋白染色均为阴性，证实为实验所需要的人牙髓细胞。2P物质对人牙髓细胞增殖与分化的影响浓度为10-9mol/L~10-5mol/L的P物质均可促进人牙髓细胞增殖（P＜0.05），提高人牙髓细胞内碱性磷酸酶的活性（P＜0.05），促增殖最佳浓度为10-6mol/L，至第5天，实验组与对照组之间差异无统计学意义，促分化最佳浓度为10-7mol/L；RT-PCR结果显示第7，14，21天，实验组牙本质涎磷蛋白mRNA的表达量均高于对照组；3P物质对人牙髓细胞超微结构的影响透射电镜下可以观察到人牙髓细胞经过P物质作用，粗面内质网明显扩张，线粒体明显增多，说明P物质增强了人牙髓细胞的合成与分泌功能。结论：1采用组织块酶解法培养的人牙髓细胞具备牙髓干细胞的特征，有良好的增殖和分化能力，可以为各种牙髓生物学的体外研究提供可靠的细胞来源。2一定浓度的P物质可以促进牙髓细胞的增殖与分化，增强牙髓细胞的合成与分泌功能，说明P物质在牙髓细胞的增殖分化过程中发挥了积极的调控作用，牙髓损伤的修复愈合过程可能有赖于P物质的参与。
【作者】田丽华；
【导师】陈惠珍；李文静；
【作者基本信息】河北医科大学，口腔临床医学，2014，硕士
【关键词】人牙髓细胞；原代培养；P物质；增殖；碱性磷酸酶；牙本质涎磷蛋白；超微结构；

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