当归多糖对人牙髓细胞增殖和成骨方向诱导分化的影响

【摘要】目的：本试验采用体外培养人牙髓细胞的方法建立实验模型，研究当归多糖（AngelicaPolysaccharides,APS）对体外分离培养的人牙髓细胞增殖与成骨方向分化的影响。方法：1牙髓细胞的分离培养和鉴定：取正畸或阻生拔除的健康年轻恒牙，运用改良组织块培养法获得体外人牙髓原代细胞并常规传代；取对数生长期的第3-5代人牙髓细胞进行爬片，按SP试剂盒说明书用SABC法进行波形丝蛋白和角蛋白的免疫组化染色，于倒置显微镜下观察。2牙髓细胞增殖活性检测：2.1CellCountingKit-8（CCK-8）试剂盒检测细胞增殖活性：取处于对数生长期的第3-5代人牙髓细胞以2×104cells/ml的细胞浓度分别接种于5个96孔培养板内,将这5组细胞随机分为4个实验组和1个对照组，实验组分别加入含1%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养液配制的四个不同浓度的当归多糖（50、100、200、400μmoL/l）；对照组加入含1%FBS的高糖DMEM培养液，每孔加液量为200微升，每板余出一列培养孔不加液（作为空白对照组）。分别于培养后的第3、6、12、24、48h弃去96孔板内原液体，加入110μl经纯DMEM培养液稀释后的CCK-8（DMEM和CCK-8的浓度配比为10:1）,随后重新置入37℃恒温培养箱内继续培育2h，以空白对照孔调零，取出后在酶标仪上测定450nm波长下各孔的吸光度值（A450）。3牙髓细胞成骨方向分化能力检测：3.1Ⅰ型胶原（CollⅠ）的表达：取处于对数生长期的第3-5代人牙髓细胞，0.25%胰蛋白酶消化后,按照2×104cells/ml的细胞浓度接种于25ml培养瓶内，每瓶3ml，共8瓶。将这8组细胞随机分为4个对照组和4个加药组，分别于培养后的第3、6、12、24h用PBS清洗3遍，加入Trizol试剂1ml，反复吹打待细胞完全溶解后，收集瓶内液体于无酶EP管中，置于－80℃冰箱保存。由北京赛百盛基因有限技术公司合成Ⅰ型胶原（CollⅠ）引物,并检测该基因的表达。3.2ALP活性表达：取处于对数生长期的第3-5代人牙髓细胞以2×104cells/ml的细胞浓度分别接种于5个96孔培养板内,将这5组细胞随机分为4个实验组和1个对照组，实验组分别加入含1%FBS的高糖DMEM培养液配制的四个不同浓度的当归多糖（50、100、200、400μmoL/l）；对照组加入含1%FBS的高糖DMEM培养液，每孔加液量为200微升，每板余出一列培养孔不加液（作为空白对照组）。分别于培养后的第6、12、24、48、72h弃去96孔板内原液体，经PBS缓冲液反复清洗3次并吸干后，每孔分别加入50μl0.1%TritonX-100，于4℃冰箱内过夜。次日，按照ALP试剂盒说明书加入底物，每孔加入量为100μl，置于37℃恒温培养箱内继续培育30min后取出，每孔分别加入0.2mol/LNaOH50μl终止反应，以空白对照孔调零，取出后在酶标仪上测定410nm波长下各孔的吸光度值（A410）。3.3骨钙素（osteocalcin，OC）合成的表达：取处于对数生长期的第3-5代人牙髓细胞，0.25%胰蛋白酶消化后,按照2×104cells/ml的细胞浓度接种于25ml培养瓶内，每瓶3ml，共14瓶。将这14组细胞随机分为7个对照组和7个加药组，分别于培养后的第1、3、5、7、9、11、13天后用PBS清洗3遍，加入Trizol试剂1ml，反复吹打待细胞完全溶解后，收集瓶内液体于无酶EP管中，置于－80℃冰箱保存。由北京赛百盛基因有限技术公司合成OC引物,并检测该基因的表达。3.4矿化结节形成的观察：茜素红染色:取处于对数生长期的第3-5代人牙髓细胞，0.25%胰蛋白酶消化后,按照2×104cells/ml的细胞浓度接种于6孔板中，分为未诱导组和诱导组，每组设5个复孔，隔日换液。分别在培养后的第7、14、28天，取出6孔板，PBS清洗3遍，用4％甲醛溶液固定约10～15min后，PBS再次清洗3遍，随后以1％茜素红染色10min，反复蒸馏水清洗，直至吸出液体呈无色透明状。倒置相差显微镜下观察、拍片记录其变化过程。采用SPSS13.0统计软件作单因素方差分析，采用S-N-K法进行多重比较。实验数据采用均数±标准差的形式，检验水准α=0.05，P<0.05为有统计学意义。结果：⒈体外培养人牙髓细胞来源鉴定：体外分离培养的人牙髓细胞经免疫组化染色结果为波形蛋白阳性表达，角蛋白阴性表达，证实该细胞来源于中胚层间充质细胞，与实验要求相一致。2.当归多糖对牙髓细胞增殖能力的影响：与对照组相比，在一定的浓度范围内，当归多糖可以促进牙髓细胞的增殖，并在作用时间为12h，药物浓度为200μmoL/l时可达到其作用峰值。3.当归多糖对牙髓细胞成骨方向分化的各个时期都具有一定的促进作用。结论:本实验结果证实当归多糖对人牙髓细胞的增殖和成骨方向分化均有一定的促进作用，且与作用时间以及药物浓度相关。
【作者】郭晗；
【导师】陈惠珍；高琪；
【作者基本信息】河北医科大学，口腔医学（专业学位），2014，硕士
【关键词】当归多糖；牙髓细胞；CCK-8；Ⅰ型胶原；碱性磷酸酶；骨钙素；矿化结节；

【参考文献】
[1]包海涛.地铁列车活塞风数值模拟[D].南京理工大学,2005.
[2]肖志松.美国专利法最新修改及其对中国的借鉴研究[D].复旦大学,法律,2012,硕士.
[3]高阳东.基于嵌入式网络的雕刻机数控系统研究与实现[D].西安科技大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[4]车红华.高等教育对地区经济的拉动作用研究[D].东北财经大学,统计学,2003,硕士.
[5]王利.列车组合定位系统信号仿真方法研究[D].北京交通大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[6]杨春波,钱洪浪,谢臻蔚,金杭美.性发育异常中外生殖器性别不清患者165例临床分析[J].中国妇产科临床杂志,2014,02:101-104.
[7]王腾蛟.河谷城市兰州热岛效应的观测与数值模拟[D].兰州大学,大气物理学与大气环境,2013,硕士.
[8]权恩雷.齐鲁石化公司醇类产品电子商务营销方案研究[D].大连理工大学,工商管理,2004,硕士.
[9]胡兆稳.罗拉轴自动检测装置控制系统与数据库的研究[D].合肥工业大学,机械电子工程,2004,硕士.
[10]王军妮.单一启动单一探测范式中负启动效应的发生机制[D].陕西师范大学,基础心理学,2014,博士.
[11]陈姣姣.无意识思维与意识思维的偏好反转[D].宁波大学,应用心理学,2014,硕士.
[12]王帅.房地产公司全面资金预算管理研究[D].北京交通大学,2013.
[13]张鑫.“60后”作家成长小说研究[D].山东师范大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[14]齐瑾.新疆移动第二枢纽楼通信规划项目管理研究[D].南京邮电大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[15]陈卫敏.江门市政府投资项目代建制研究[D].华南理工大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[16]李松伟.三峡库区丘陵柑橘园土壤营养状况与变量施肥技术研究[D].西南大学,植物学,2013,硕士.
[17]王鹏.成都纺专大学毕业设计信息管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[18]林福臻.肝癌患者介入治疗前的营养不良风险调查与分析[D].广西医科大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[19]王金达.碳酸酐酶抑制剂甲苯磺烷唑胺非临床药代动力学特征[D].中国人民解放军军事医学科学院,药理学,2013,硕士.
[20]王晓屹.应用Logistic回归模型分析甲状腺良恶性结节的超声特征[D].苏州大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[21]戈化聪.心理教育对大学生德育实现途径的研究[D].太原科技大学,思想政治教育,2013,硕士.
[22]赵建红.论公司人格否认制度[D].中国政法大学,民商法学,2003,硕士.
[23]吴迪.A公司员工知识共享影响因素及激励策略研究[D].广东工业大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[24]刘璐.外商直接投资对我国产业安全的影响研究[D].河北经贸大学,国际贸易学,2012,硕士.
[25]李明羽.优势视角理论下机构养老中失能老人的照料研究[D].中国社会科学院研究生院,社会政策（专业学位）,2014,硕士.
[26]刘雪涛.中国民族民间舞蹈即兴课程研究[D].中国艺术研究院,舞蹈学,2013,硕士.
[27]邓林林.湖北省城市化质量评价及其时空差异分析[D].华中师范大学,自然地理学,2014,硕士.
[28]莫道平.含瓦斯煤流固耦合数学模型及其应用[D].重庆大学,力学,2014,硕士.
[29]王庆东.基于粗糙集的数据挖掘方法研究[D].浙江大学,2005.
[30]徐蓓.中草药名称理据的认知研究[D].华东师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[31]安光辉.天津A公司人力资源规划研究[D].西南交通大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[32]杨秀秀.江浙县域经济空间差异研究[D].宁波大学,区域经济学,2014,硕士.
[33]李忠阳.锂离子电池用凝胶聚合物电解质的研究与开发[D].浙江大学,材料物理与化学,2004,硕士.
[34]石慧.基于高光谱成像技术的对虾品质信息快速检测方法研究[D].浙江大学,农业机械化,2013,硕士.
[35]孙树荣.沪深300指数期货动态保证金设定研究及效率评估[D].复旦大学,金融学,2012,硕士.
[36]张禹舜.水稻叶鞘突变体yjs和淀粉突变体q4359的表型分析及基因精细定位[D].南京农业大学,遗传学,2011,硕士.
[37]申勇兵.高空抛物致害救济途径研究[D].扬州大学,民商法学,2011,硕士.
[38]田燕.审美神义论与清教神义论[D].四川外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[39]胡守毅.论数据仓库的技术应用[N].人民邮电,2002-11-21003.
[40]乔宗正.用户满意度在美国(上)──国家轻工业局组团赴美执行用户满意度评价培训与考察[J].电子质量.2001(04)
[41]李响.基于统计模型的数字图像拼接篡改盲鉴别算法的研究[D].吉林大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[42]郑新颖.中小学生的社会音乐教育现状研究[D].天津音乐学院,音乐学,2013,硕士.
[43]周泽春.量刑建议制度的经济分析[D].华中科技大学,经济法学,2013,硕士.
[44]李小卫.液压顶升卸载技术在粘贴加固中的应用[D].长安大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[45]江祥.JF矿业公司持续竞争优势培育研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[46]钱南兮.宝钢4063m~3高炉装料胶带的控制及模拟[J].冶金自动化,1987,01:21-26.
[47]李锐利.关于我国大学毕业生就业问题的研究[D].华东师范大学,教育经济与管理,2004,硕士.
[48]尹苹苹.新型荧光纳米探针的设计及应用[D].长春工业大学,2014.
[49]苏鹤群.悬挂式手术台承重结构稳定性分析[D].苏州大学,纺织工程（专业学位）,2013,硕士.
[50]侯恩科,吴立新,李建民,吴育华,董荣泉,邓智毅,刘宏军.三维地学模拟与数值模拟的耦合方法研究[J].煤炭学报,2002,04:388-392.