miRNA-145对SHR动脉VSMC的表型调控作用及其机制研究

【摘要】第一部分miR-145在SHR动脉VSMC中的表达及细胞表型测定目的：(1)观测miR-145在8、12、16、20周(W)龄SHR胸主动脉VSMC中的表达的情况,并分别与相同周(W)龄Wistar大鼠相比较(2)检测VSMC的细胞表型标志a-SMA和SMemb在8、12、16、20W龄SHR胸主动脉VSMC中的表达的情况,并与Wistar大鼠相比较；(3)分别测量8、12、16、20W末SHR和Wistar大鼠的动脉收缩压(SAP)、动脉舒张压(DAP)和平均动脉动脉压(MAP),并相互比较；(4)测量8、12、16、20W末SHR和Wistar大鼠的胸主动脉中膜厚度(MT)、中膜面积(WA)/内腔面积(LA)百分比,并相互比较；(5)作不同周龄SHRmiR-145相对表达量与对应周龄的MT和SAP的相关性分析。方法：Real-timePCR法检测miR-145在不同周龄SHR和Wistar大鼠胸主动脉VSMC中的表达；Real-timePCR法和Western-blot法检测VSMC的表型标志a-SMA和SMemb的mRNA和蛋白在SHR和Wistar大鼠胸主动脉中的表达情况；ALC-NIBP无创血压测量分析系统测量不同周龄SHR和Wistar大鼠的血压；HE染色切片观测胸SHR和Wistar大鼠的胸主动脉VSMC的形态、中膜厚度(MT)、中膜面积(WA)/内腔面积(LA)百分比。结果：(1)SHR的miR-145的相对表达量明显低于Wistar大鼠(p<0.05)；随SHR周龄的增加miR-145的相对表达量逐步下降(P＜0.05),但16周后组内比较差异无统计学意义；不同周龄Wistar大鼠的miR-145的相对表达量无明显差异(p>0.05)；(2)SHR的a-SMA的mRNA和蛋白相对表达量明显低于Wistar大鼠(p<0.05)；而SMemb的mRNA和蛋白相对表达量明显高于Wistar大鼠(p<0.05)；随SHR周龄的增加α-SMA的mRNA和蛋白相对表达量逐步下降(p＜0.05),而SMemb的mRNA和蛋白相对表达量逐步增加(p<0.05),但16周后组内比较差异无统计学意义；不同周龄Wistar大鼠的α-SMA和SMemb的mRNA和蛋白相对表达量无明显差异(p>0.05)；(3)SHR的SAP、DAP、MAP明显高于Wistar大鼠(P＜0.05)且随周龄增加逐步增高(p<0.05),16周后血压增加达高峰,此后维持在这一高水平；Wistar大鼠血压在正常范围内,不随周龄增加逐步增高；(4)HE切片观察,SHR主动脉壁明显比Wistar大鼠增厚,平滑肌细胞层增多,排列紊乱,弹力纤维明显扭曲,且随周龄增加,平滑肌细胞层也逐步增多；而Wistar大鼠各弹力纤维层排列整齐有序；经测量SHR的MT、WA/LA均比Wistar大鼠增加(p<0.05),且有随周龄增长而增加的趋势；不同周龄Wistar大鼠MT、WA/LA差异无统计学意义(p>0.05)；(5)相关分析提示：SHR的miR-145相对表达量与其血压和MT呈明显负相关(p<0.01)。结论：(1)miR-145在SHR和Wistar大鼠胸主动脉VSMC中均有表达；在、Vistar大鼠中高表达,在SHR中明显低表达,且随SHR血压升高表达有下降趋势；(2)SHR和Wistar大鼠胸主动脉VSMC表型不同；SHR胸主动脉VSMC表型为合成型,Wistar大鼠胸主动脉VSMC表型为收缩型;(3)随SHR血压升高、MT增厚,miR-145相对表达量下降。第二部分药物干预对miR-145在SHR动脉VSMC中表达及细胞表型的影响目的：探讨在药物干预降低SHR血压后,miR-145在SHR动脉VSMC中表达是否受到影响,以及VSMC的表型是否发生改变?同时观测与VSMC增殖相关的基因表达变化情况。方法：16周龄雄性SHR30只随机分为2组：对照组(SHRc组)和缬沙坦(Valsartan,代文)干预组(SHRv组)。SHRv组给予30mg/kg/d缬沙坦灌服,SHRc组灌服同体积的生理盐水。在干预0W、6W、12W末测定各组的SAP、DAP和MAP,并进行比较；同时,Real-timePCR法检测miR-145在SHRc组和SHRv组胸主动脉VSMC中的表达差异；Real-timePCR法和免疫组织化学法检测VSMC的表型标志a-SMA和SMemb的mRNA和蛋白在两组间胸主动脉中的表达情况；和VSMC增殖相关的基因p38MAPK和KLF-5的mRNA和蛋白在两组间表达差异；利用HE切片染色观测两组胸主动脉VSMC的形态、中膜厚度(MT)、中膜面积(WA)／内腔面积(LA)百分比的差异。结果：(1)SHRv组SAP、DAP、MAP随干预时间延长而逐步下降,one-wayANOVA显示干预0W、6W和12W时两两相比差异有统计学意义(F=37.46,p=0.0000);SHRc组SAP、DAP、MAP不随干预时间延长而减小,两两相比差异无统计学意义(p>0.05)；SHRv组血压较对照组SHRc明显降低(p<0.05)；(2)SHRv组胸主动脉VSMC中miR-145相对表达量随干预时间延长逐步增加,统计分析显示干预0W、6W和12W时两两相比差异有统计学意义(F=25.13,p=0.0000),SHRc组miR-145相对表达量不随干预时间延长而增加；SHRv组miR-145相对表达量在干预0W、6W和12W末较对照组SHRc均明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05)；相关性分析表明：随SHRv组血压下降,miR-145相对表达量逐步增加,两者显著负相关(r=-0.8176)；(3)SHRc组的α-SMA.SMemb.p38MAPK.及KLF-5mRNA的相对表达量在各自不同的干预时间相比较,差异均无统计学意义(F=0.78,p=0.69；F=0.89,p=0.53；F=1.21,p=0.27；F=0.67,p=0.91)；SHRc组的α-SMA、SMemb、p38MAPK、及KLF-5mRNA的相对表达量在各自不同的干预时间相比较,one-wayANOVA显示差异均统计学意义(F=9.81,p=0.00；F=7.04,p=0.00；F=4.28,p=0.03；F=5.88,p=0.006)；SHRc组的α-SMAmRNA的相对表达量随缬沙坦干预时间延长而逐步增加,而其余几个因子的mRNA的相对表达量都随缬沙坦干预时间延长而逐步下降；各因子的蛋白表达量情况与mRNA的表达量相似；(4)HE切片观察,SHRv组刚入组时,见主动脉明显增厚和中膜弹力纤维增生,排列紊乱,弹力纤维明显扭曲；随血压下降,SHRv组主动脉增厚和中膜弹力纤维增生明显减轻；而SHRc组在整个观察期间主动脉明显增厚和中膜弹力纤维增生现象无改善；干预后SHRv与SHRc相比,中膜增厚、中膜面积／内腔面积减少(p均<0.05)。结论：(1)血管紧张素II(AT1)受体拮抗剂缬沙坦能降低SHR的SAP、DAP、MAP;(2)随SHR血压下降,SHR胸主动脉VSMC的miR-145表达逐步增高；VSMMC的细胞表型由合成型向收缩型转换；(3)随血压下降,SHR胸主动脉VSMC的增殖减轻；VSMC增殖的相关因子表达减少。第三部分抑制和过表达miR-145改变SHR动脉VSMC的表型目的：进一步探讨miR-145在SHR动脉VSMC的表型转换中的作用,观测转染不同浓度niR-145mimics和inhibitors对SHR动脉VSMC的表型的影响。方法：取8周龄雄性SHR胸主动脉,采用组织贴块法体外培养VSMC,并用免疫组织化学方法进行验证。采取传代至6-8代VSMC进行干预试验。利用lipofectamineTM2000将不同浓度(3nM、50nM、100nM)的miR-145mimics和inhibitors分别转入VSMC,继续孵育24h后,Real-timePCR检测转染不同浓度miR-145mimics和inhibitors后,α-SMA和SMemb的mRNA在VSMC中的表达情况；MTT法检测转染不同浓度miR-145mimics和miR-145inhibitors48h后VSMC的增殖情况。结果：(1)采用组织贴块法成功培养出VSMC,免疫细胞化学检测VSMC阳性细胞的纯度>99%；(2)转染不同浓度miR-145mimics后,VSMC的α-SMAmRNA相对表达量呈浓度依赖性增高,方差分析显示不同miR-145mimics转染浓度下,α-SMAmRNA相对表达量增高差异有统计学意义(F=36.63,P=0.00);100nM组miR-145mimics过表达使α-SMAmRNA相对表达量是Mock组的4.71倍。(3)转染miR-145mimics对VSMC的SMembmRNA相对表达量呈浓度依赖性降低,方差分析显示不同miR-145mimics转染浓度下,SMembmRNA相对表达量降低差异有统计学意义(F=14.84,p=0.02);100nMmiR-145mimics组的SMembmRNA相对表达量仅是Mock组表达量的30.47%；(4)转染miR-145inhibitors使VSMC的a-SMAmRNA相对表达量呈浓度依赖性降低,方差分析显示不同miR-145inhibitors转染浓度下,a-SMAmRNA相对表达量降低差异有统计学意义(F=27.06,p=0.00);100nMmiR-145inhibitors组的a-SMAmRNA相对表达量仅是Mock组表达量的26.48%；(5)转染niR-145inhibitors对VSMC的SMembmRNA相对表达量呈浓度依赖性增高,方差分析显示不同miR-145inhibitors转染浓度下,SMembmRNA相对表达量增高差异有统计学意义(F=17.29,p=0.03)：100nM组miR-145inhibitors过表达使SMembmRNA相对表达量是Mock组的2.08倍；(6)MTT检测显示：50nM、100nMmiR-145mimics,分别使VSMC增殖活性减少27.6%±7.8%、67.4±9.3%,两两相比差异有统计学意义(p<0.05)；而50nM.100nMmiR-145inhibitors,分别使VSMC增殖活性增加了145.2%±11.2%、205.7士15.6%,两两相比差异有统计学意义(p<0.05)结论：(1)miR-145能调控VSMC细胞表型转换；抑制miR-145表达,使VSMC表型向合成型转换；过表达miR-145,使VSMC表型向收缩型转换；(2)过表达miR-145能抑制VSMC增殖；抑制miR-145表达促进VSMC增殖；第四部分miR-145通过p38MAPK信号通路调控VSMC表型转换目的：探讨miR-145是否通过p38MAPK信号通路调控动脉VSMC表型转换。方法：(1)过表达和抑制miR-145后,Real-timePCR检测p38MAPK与KLF-5的mlRNA在VSMC中的表达情况；Western-blot检测Myocardin和KLF-5的蛋白表达情况；(2)p38MAPK与KLF-5在VSMC表型转换中的关系：VSMC按实验需要分为3组,正常对照组；AngⅡ诱导组；SB203580处理组。正常对照组为传代至6-8代的VSMC；AngⅡ诱导组：加入AngⅡ终浓度为10-7M诱导后的VSMC;SB203580处理组为先加入终浓度为10-6Mp38MAPK的抑制剂SB2035804h后,再加入AngⅡ终浓度为10-7的干预后VSMC。Real-timePCR检测p38MAPK抑制剂SB203580对AngⅡ诱导大鼠VSMC的a-SMA、SMembmRNA表达的影响,同时Western-blot检测p-p38MAPK和KLF-5的蛋白表达情况；MTT检测VSMC增殖情况；结果：(1)转染niR-145mimics后,VSMC的p38MAPK和KLF-5的mRNA相对表达量呈浓度依赖性降低,方差分析显示不同miR-145mimics转染浓度下,p38MAPK和KLF-5mRNA相对表达量降低差异均有统计学意义(F=53.19,p=0.00；F=38.70,p=0.00)；两者高度正相关；(2)转染niR-145inhibitors后,VSMC的p38MAPK和KLF-5的mRNA相对表达量呈浓度依赖性增加,方差分析显示不同miR-145inhibitors转染浓度下,p38MAPK和KLF-5mRNA相对表达量增加差异均有统计学意义(F=13.77,p=0.00；F=7.16,p=0.02)；两者高度正相关；(3)MTT检测显示：与对照组相比,AngⅡ诱导组使VSMC增殖活性增加了236.3%±13.6%,而SB203580处理组与对照组相比VSMC增殖活性增加120.7±5.4%。AngⅡ诱导组与对照组、SB203580处理组相比差异均有统计学意义(p<0.01)；但对照组与SB203580处理组相比差异无统计学意义(p>0.05)；(4)与对照组相比,AngⅡ诱导组a-SMA的mRNA表达明显减少,为对照组的0.37±0.04倍,而SMembmRNA的mRNA表达却明显增加,为对照组的3.27±0.68倍,差异均有统计学意义(p<0.05)；与对照组相比,SB203580处理组a-SMA的和SMembmRNA的表达相差不大,分别为对照组的1.12±0.06倍和1.23士0.12倍,差异无统计学意义(p>0.05)(5)Western-blot结果显示：AngⅡ能诱导p-p38MAPK和KLF-5的蛋白表达,且与对照组相比,差异均有统计学意义(p<0.05)；给予P-38MAPK抑制剂后,p-p38MAPK和KLF-5的蛋白表达均明显减少,与对照组及AngⅡ诱导组相比,差异均有统计学意义(p<0.05)；(6)过表达和抑制miR-145对KLF-5、p-p38MAPK和Myocardin的蛋白表达均有影响；Western-blot结果显示：Myocardin、KLF-5和p-p38MAPK的蛋白农达,在对照组及miR-145inhibitors组和miR-145mimics组两两相比差异均有统计学意义(p<0.05)p-p38MAPK和KLF-5蛋白的表达显著负相关；而KLF-5和Myocardin蛋白的表达显著负相关。结论：(1)miR-145通过p38MAPK信号通路调控动脉VSMC表型转换；(2)在p38MAPK信号通路中,p38MAPK正相调控KLF-5的表达；KLF-5再负相调控Myocardin的表达；进而调控动脉VSMC表型转换；(3)AngⅡ能诱导VSMC表型由收缩型向合成型转换；抑制p38MAPK表达后能阻止AngⅡ诱导的VSMC表型转换。
【作者】嵇利亚；
【导师】姜德谦；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】miR-145；SHR；VSMC表型；α-SMA；SMemb；Smemb；p38MAPK；KLF-5；miR-145inhibitors；miR-145mimics；AngⅡ；SB203580；Myocardin；

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