Runx1在脑死亡供体肝脏中作用机制研究

【摘要】第一章兔脑死亡肝脏差异蛋白表达趋势检测目的根据前期蛋白质组学技术筛选出的显著性差异蛋白Runx1,研究其在脑死亡肝脏中表达趋势变化。方法使用免疫组化、PCR、westernblot在转录翻译水平验证Runx1蛋白在脑死亡肝脏中表达水平变化。结果免疫组化、RT-PCR、Westernblot检测脑死亡后Runx1蛋白在肝脏中表达水平变化,发现随着脑死亡持续时间延长,Runx1蛋白呈下降趋势,在8小时时间点表达水平最低(P<0.05)。结论缓慢间断颅内加压法脑死亡后肝脏采用双向凝胶电泳和质谱分析,鉴定出Runx1蛋白表达水平在脑死亡前后肝脏细胞中有显著变化,该蛋白定位于细胞核内,是细胞增殖与分化相关蛋白质,随着脑死亡时间的延长,在肝脏中的表达逐渐减少,可能参与致肝脏损伤过程。第二章Runx1蛋白对缺血缺氧肝脏细胞作用的体外实验研究目的体外细胞实验探索Runx1蛋白对缺血缺氧肝脏细胞的作用。方法使用质粒为载体的全长度Runx1cDNApEGFP-N1-RUNX1转染大鼠肝脏,使Runx1基因过表达；转染pEGFP-N1为阴性对照组,对质粒转染后的大鼠肝脏细胞进行缺血缺氧处理；实验分为四组：对照组(C组)、缺血缺氧组(IS)、转染阴性对照+缺血缺氧组(S+IS)、Runxl过表达+缺血缺氧组(OS+IS)。流式细胞仪检测各组大鼠肝脏的细胞凋亡率,检测TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-αmRNA表达水平,研究Runxl蛋白对缺血缺氧细胞肝脏作用机制。结果pEGFP-N1-RUNX1转染大鼠肝脏细胞48小时后Rux1蛋白表达水平达到峰值。PCR和Westernblot检测Runx1表达水平在IS组和S+IS组较对照组明显降低(P<0.05),在OS+IS组较对照组表达明显升高(P<0.01)。流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,IS组和S+IS组较对照组细胞凋亡明显升高(P<0.01),OS+IS组细胞凋亡率较IS组和S+IS组明显降低(P<0.05)。PCR检测大鼠肝脏细胞各组TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-αmRNA表达水平。在IS组、S+IS组、OS+IS组中,TGF-13mRNA表达水平全部升高(P<0.05),三组之间没有明显差异(P>0.05)。在IS组和S+IS组中,Bcl-2mRNA与C组相比表达水平显著降低(P<0.05),但两组间没有统计学差异(P>0.05),Bim、TNF-α表达水平显著升高(P<0.05)；在OS+IS组中Bcl-2mRNA表达水平明显升高(P<0.05),Bim、TNF-αmRNA表达水平明显降低(P<0.05)。Runx1表达水平的改变引起了Bcl-2/Bim、TNF-αmRNA表达水平的显著改变,因此Bcl-2/Bim、TNF-α是受到Runx1蛋白调控的下游信号分子。结论体外细胞实验证实,肝脏细胞在缺血缺氧后,Runx1明显降低,TGF-β、Bim、TNF-α等细胞凋亡相关因子明显升高；采用pEGFP-N1-RUNX1真核载体转染方法可有效的使Runx1在转录和翻译水平表达增加。过表达Runx1后,TGF-β表达含量无明显变化,而Bcl-2、Bim、TNF-α等凋亡相关因子表达显著变化；过表达Runx1后细胞凋亡率显著降低,这与Runx1诱导凋亡抑制因子Bcl-2升高并使得促凋亡因子Bim、TNF-α表达降低有关。Runx1是通过调控Bcl-2/Bim家族表达,经线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡；同时,Runx1促进TNF-α表达,通过细胞外凋亡途径引起细胞凋亡；第三章Runx1蛋白对脑死亡大鼠肝脏细胞作用机制的在体实验研究目的通过脑死亡大鼠在体实验研究进一步证实TGF-β-Runx1-Bcl-2/Bim和TGF-β-Runx1-TNF-α信号通路对脑死亡肝脏细胞作用机制。方法高压注射质粒转染大鼠尾静脉pEGFP-N1-RUNX1,并实行脑死亡手术。将实验分为假手术组(C组)、脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD)、Runxl过表达+脑死亡组(OS+BD).检测各组肝脏在2h、4h、6h、8h时间点ALT、AST水平和肝脏形态学变化,以观察各组肝脏功能损伤；PCR检测各组2h、4h、8h时间点Runx1、TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-αmRNA表达水平,验证Runx1对肝脏作用机制。结果高压注射质粒转染大鼠尾静脉pEGFP-N1-RUNX1在48小时后Runx1表达达到峰值,后逐渐下降。检测各组ALT、AST水平,与对照组相比,BD组与S+BD组ALT、AST的水平明显升高(P<0.05),但两组问相差无统计学意义(P>0.05);OS+BD组在各个时间点血清中ALT、AST水平较BD组与S+BD组降低,差异均具有统计学意义(P<0.01)。肝脏形态学检测显示,与BD组相比,OS+BD组各时间点肝脏细胞损伤程度均减轻PCR检测大鼠肝脏细胞假手术组(C组)、脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD)、Runx1过表达+脑死亡组(OS+BD)中2h、4h、8h时间点Runxl、TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-αmRNA表达水平,GAPDH为参照。在各个时间点,脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD)、Runx1过表达+脑死亡组(OS+BD)TGF-βmRNA表达水平升高,三组处理方式间无统计学差异(P<0.05)。在各个时间点与假手术组相比,脑死亡组(BD)、转染阴性对照+脑死亡组(S+BD)Bcl-2mRNA表达水平降低,Bim、TNF-α表达水平升高(P<0.05)；而Runx1过表达+脑死亡组(OS+BD),Bcl-2mRNA表达水平明显升高,而Bim、TNF-α表达水平降低(P<0.05),相对应肝脏形态学,肝脏细胞坏死凋亡面积减轻,炎症细胞浸润减少。结论Runx1在体大鼠脑死亡实验证实,Runx1在脑死亡肝脏中表达含量的降低,引起肝脏细胞凋亡增加；Runx1对肝脏细胞的作用是通过TGF-β-Runx1-Bcl-2/Bim和TGF-β-Runx1-TNF-α信号通路来发挥对缺血缺氧肝脏细胞作用的。Bcl-2/Bim、TNF-α受到Runx1的表达调控,是Runxl的下游靶基因。
【作者】赵杰；
【导师】叶啟发；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】脑死亡；蛋白质组学；RUNX1；脑死亡供体；肝脏；过表达；在体实验研究；Bcl-2；Bim；TNF-α；

【参考文献】
[1]陈斌.桃花岛主精准出击水利高铁一个都不少[J].股市动态分析,2011,04:26.
[2]杨杰,叶晨洲,陈念贻.DBMiner数据挖掘平台及其应用[J].系统仿真学报,2001,06:740-742+780.
[3]卢熊熊.可变齿厚测量齿轮的设计与研究[D].苏州大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[4]田胜利.针对HBase的MapReduce数据访问方式的优化[D].国防科学技术大学,计算机科学与技术,2012,硕士.
[5]王娟,石艳丽,姚立峰,王霞.地震勘探数据存储技术研究与应用[J].石油地球物理勘探,2008,S1:163-167+193+196+13.
[6]冯佳.目的论视角下神秘学文本的汉译[D].兰州大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[7]王瑾.农村土地征用过程中多元利益主体博弈的社会学分析[D].山东大学,社会学,2013,硕士.
[8]韩晓晨.我国私募股权基金退出机制法律问题研究[D].首都经济贸易大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[9]张宁宁.河北省银行业发展与经济增长关系研究[D].河北经贸大学,数量经济学,2012,硕士.
[10]鞠方.中国经济增长中的居民收入分配问题探析[D].湘潭大学,政治经济学,2001,硕士.
[11]张俊婷.山药多糖提取工艺优化及其抗菌活性研究[D].佳木斯大学,药剂学,2014,硕士.
[12]许红杰.平行交通系统的可信度评估方法研究[D].北京交通大学,2014.
[13]乔祖琴.项目管理方法在高校辅导员绩效考核体系中的应用[D].南京邮电大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[14]王燕青.基于行为需求的城市商业街公共空间设计研究[D].长安大学,城市规划与设计,2014,硕士.
[15]段炜佳.粗糙集理论与专家系统相结合的电网故障诊断系统的研究[D].华北电力大学（北京）,电力系统及其自动化,2003,硕士.
[16]夏芸帆.相邻不可量物侵害的容忍义务研究[D].扬州大学,民商法学,2011,硕士.
[17]孙进,李清海,李国岫,蒙爱红,张衍国.城市生活垃圾焚烧中NaCl迁移转化的实验和热力学平衡分析[J].中国电机工程学报,2014,02:272-278.
[18]龚芳.加味炙甘草汤治疗冠心病心绞痛室性期前收缩阴阳两虚证的临床研究[D].湖南中医药大学,中医内科学,2014,硕士.
[19]梁兆枢,王国刚.新型疏水阀的研制[J].北京节能.1989(02)
[20]黄世纯.中学语文教学人格教育功能之研究[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[21]谢亚.北京地区入境生物试剂共同配送系统构建研究[D].北京交通大学,2014.
[22]于丹.中石油吉林长春分公司成品油营销策略研究[D].吉林大学,工商管理,2012,硕士.
[23]张丽丽.我国服务贸易对制造业国际竞争力影响的实证分析[D].山东财经大学,国际贸易学,2014,硕士.
[24]石晓磊.基于对角载入的鲁棒自适应波束形成算法的研究[D].东北大学,控制理论与控制工程,2009,硕士.
[25]王斌.LM企业钼矿资源综合利用研究[D].河南科技大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[26]慈佳宾.玉米单倍体诱导和加倍技术及DH系的遗传研究[D].吉林农业大学,作物遗传育种,2012,硕士.
[27]李星.发达国家对外援助的效果分析[D].厦门大学,世界经济,2014,硕士.
[28]姚连营.高校校园网络文化建设和管理研究[D].浙江大学,2009.
[29]刘松.基于云计算的企业SaaS个性化信息服务系统模型研究[D].华侨大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[30]冯海涛.农杆菌介导的水稻纹枯病菌T-DNA插入突变及水稻纹枯病抗性材料筛选[D].四川农业大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[31]苏怀智.大坝安全监控感智融合理论和方法及应用研究[D].河海大学,2002.
[32]鲍小鹏.基于DSP的高压输电线路保护的研究[D].华北电力大学（河北）,电力系统及其自动化,2004,硕士.
[33]储昭将.我国养老保险制度研究[D].南京大学,社会保障（专业学位）,2013,硕士.
[34]陈亚琦.基于供求视角的“中等收入陷阱”分析与对策——来自日本与韩国的经验[J].河北经贸大学学报,2014,05:60-66.
[35]王震.国债期货价格发现功能研究[D].西南财经大学,金融学,2013,博士.
[36]吕海林.多种成品油管输监控系统的研究[D].哈尔滨理工大学,测试计量技术及仪器,2012,硕士.
[37]袁景.基于多用户检测技术的CDMA无线网络优化实证研究[D].复旦大学,软件工程,2012,硕士.
[38]张敏.共振瑞利散射法测定某些α_1受体阻滞剂类药物的方法研究[D].西南大学,分析化学,2013,硕士.
[39]孟石.催化裂化装置三维教学培训系统的研究与开发[D].华东理工大学,化学工程,2014,硕士.
[40]林建国.基于ASP.NET的校园轻博客系统研究与设计[D].厦门大学,计算机技术,2014,硕士.
[41]吴伟.基于系统级仿真的LTE资源调度研究[D].南昌航空大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[42]刘亚静,范瑜.《交流伺服控制系统》系列讲座(七)第7讲交流伺服系统的状态观测相关问题[J].伺服控制,2014,10:79-82.
[43]李露露.论微博语言幽默的语域及其体现[D].河北大学,英语语言文学,2014,硕士.
[44]宋卫荣.基于小波变换和人工神经网络的图像识别研究[D].苏州大学,通信与信息系统,2003,硕士.
[45]刘佳燚.基于稀疏表示目标跟踪的交通事故分析系统设计与实现[D].中山大学,软件工程,2014,硕士.
[46]陈博通.DTDX集团公司企业年金管理方案[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[47]汤玮.急性ST段抬高型心肌梗死急诊PCI术前负荷剂量阿托伐他汀治疗长期疗效观察[D].河北医科大学,内科学,2013,硕士.
[48]汪涛.传爆药输出压力试验方法研究[D].中北大学,军事化学与烟火技术,2014,硕士.
[49]王昕.交换型多兆比特数据业务及其发展[J].现代电信科技.1995(10)
[50]朱莉.数据挖掘与企业竞争优势[J].情报杂志,2003,11:43-44.