颞叶癫痫共阿尔茨海默氏病样神经病变实验病理学探讨

【摘要】第一部分癫痫CDl小鼠前脑淀粉样斑及tau病变相关蛋白表达实验原理与目的：以往颞叶癫痫人脑病理学检测发现淀粉样斑和神经原纤维缠结等阿尔茨海默病(AD)样病理改变。啮齿类皮罗卡品癫痫模型能重建人颞叶癫痫的大部分病理学、异常脑电脑活动及癫痫行为学改变。本部分实验拟采用CD1小鼠建立皮罗卡品癫痫模型。通过行为学、电生理及经典组织学方法证实小鼠模型的成功建立。在此基础上,观察和确立与淀粉样斑和神经原纤维缠结形成相关的蛋白表达在癫痫小鼠脑内的变化及其程度。材料与方法：采用2月龄成年CD1小鼠,腹腔注射皮罗卡品诱导实验性颞叶癫痫,对照组腹腔注射生理盐水。在不同存活时间点(24-48小时,及7、14、30、60天)进行电生理和/或脑组织学处理。组织学与免疫组织化学染色比较癫痫和对照动物海马和边缘系统区域的细胞构筑、轴突芽生,淀粉样蛋白(Ap)及其生成酶贝塔分泌酶1(BACE1)、磷酸化tau和其他相关神经元标记物表达和分布。结果：行为学和电生理检测证实皮罗卡品处理CD1小鼠表现复发性痉挛癫痫发作和海马痫性放电。Timm染色和神经肽(NPY)免疫组化证实癫痫小鼠CA3区苔藓纤维末梢芽生。存活7天及以上癫痫动物尼氏染色显示海马CA1和CA3区细胞死亡。在存活7至60天组癫痫小鼠,贝塔分泌酶1(BACE1)上调伴随苔藓纤维及梨状皮质、杏仁核等亚区轴突芽生,以及局部树突标志物MAP2免疫反应缺失。癫痫小鼠未表现细胞外淀粉样蛋白沉着和磷酸化人样tau蛋白过表达。总结与结论：匹罗卡品诱导CD1小鼠产生慢性复发性颞叶癫痫行为学和神经病理学改变。海马和其它颞叶区域出现局部BACE1表达上调,定位于异常芽生轴突末梢。在BACE1上调的同一区域,存在树突成分损伤或丢失。在缺乏人为(病理／态基因)诱导可能产生脑可溶性Aβ高水平的前提下,颞叶癫痫脑内发生过度生成Ap的神经元调控变化；尽管在成年CD1小鼠,实验性癫痫未引起典型脑淀粉样斑和神经原纤维缠结病变。第二部分转基因3XTg-AD小鼠AD样神经病理发生与演化实验原理与目的：转基因3×Tg-AD小鼠随年龄发育而出现脑组织细胞外淀粉样斑和神经元内tau蛋白过磷酸化病变。本实验将对课题组繁殖的3×Tg-AD小鼠淀粉样斑和tau病变的年龄和脑区域相关性演化进行评估。此外,尚无研究报道3×Tg-AD小鼠脑内是否存在BACE1表达异常。本实验也旨在明确BACE1与3XTg-AD小鼠脑淀粉样斑病变的相关性。材料与方法：采用雄性3XTg-AD及非转基因小鼠,1-26月龄。脑组织行生化和免疫组化分析。各月龄组脑邻片进行BACE1,Aβ和磷酸化tau(p-tau)染色。特定年龄组脑切片行荧光双标(1)BACE1与Aβ、p-tau,(2)N-端,中段或C-端特异性Aβ抗体交互双标,(3)BACE1与特异神经元标记物。免疫印迹法检测BACE1和其直接产物淀粉样蛋白前体(APP)贝塔位点剪切片段(p-CTF)水平,酶试剂盒检测BACE1酶活性。结果：(1)3×Tg-AD小鼠前脑内12-14月龄开始出现Aβ染色阳性淀粉样斑,始见于海马下托,随年龄扩展至海马与皮质各层,可见致密型斑,但多为弥散型。BACE1阳性失营养性突起的出现和扩展呈现上述相同时空演化过程。(2)AβN-端(3D6,6E10)和中段(4G8,E50)特异抗体显示皮质和海马锥体神经元胞体,2月龄即出现。经强蚁酸切片预处理,还标记肿胀样轴突末梢,4-6月龄开始出现。这些轴突末梢可被BACE1及β-CTF抗体荧光共标记。(3)AβC-端特异抗体仅显示胞外淀粉样蛋白沉着。(4)磷酸化tau蛋白反应产物存在于部分皮质和海马锥体神经元胞体和树突,2月龄即出现,随年龄增加而增强。(5)与非转基因小鼠相比,3×Tg-AD小鼠脑BACEKβ-CTF、BACE1酶活性水平从12—14月龄开始增加,18—22月龄达到统计学意义。总结与结论：3×Tg-AD小鼠脑淀粉样和tau病变表现年龄和区域相关性发生和进展过程,但两者之间无明显相关性。脑淀粉蛋白沉积可表现为致密型和弥散型,两者的发生可能均与先期出现的轴突病变有关。早期轴突病变表现为肿胀和芽生,伴随BACE1和一些Aβ抗体染色阳性染色,后者可能代表APPβ-CTF聚集。BACE1上调在3×Tg-AD小鼠脑淀粉样斑的起始和演化过程中扮演关键作用。第三部分癫痫3×Tg-AD小鼠AD样神经病理发生与变化实验原理与目的：我们在第一部分实验发现脑BACE1上调伴随癫痫CD1小鼠边缘系统病理性轴突芽生。第二部分实验证实BACE1上调定位于早期肿胀轴突末梢和失营养性神经突起,并伴随3×Tg-AD小鼠脑淀粉样斑发生过程。本部分研究从实验病理学角度探讨皮罗卡品癫痫是否提前和促进3XTg-AD小鼠脑淀粉样斑和tau病变。本实验旨在检测癫痫脑内进行性轴突病变因伴随BACE1上调会脑区域特异性的引起淀粉样斑形成,也可能与tau蛋白过度磷酸化相关。通过这些观察,试图阐述颞叶癫痫表现AD样神经病变的病理发生机制。材料与方法：采用6-8月龄雄性3XTg-AD小鼠,皮罗卡品腹腔注射诱导急性痉挛性惊厥,对照组腹腔注射生理盐水。录像监控证实皮罗卡品组动物出现发作性、痉挛性惊厥。动物存活至9、11和14月龄(n=4/年龄组),行脑组织学与免疫组织化学检测,对海马和边缘系统区域的细胞构筑、BACE1、APP、Aβ、p-tau和神经元特异核抗原(NeuN)免疫反应阳性产物进行定性定量分析。结果：(1)与对照组相反,癫痫3XTg-AD小鼠呈现典型海马苔藓纤维芽生,表现为齿状回分子层内份出现BACE1强染色带。(2)在9和11月龄癫痫小鼠,海马、梨状皮质和杏仁核出现BACE1阳性失营养性神经突起簇、而对照组无或罕见此类结构。在14月龄癫痫小鼠,这些失营养性神经突起簇的数目多于对照组,且分布比对照组广泛。(3)双重标记分析表明BACE1日性失营养性神经突起为轴突成分,且伴随局灶性细胞外Ap沉积。(4)定量分析表明癫痫小鼠海马CA1和下托区失营养性神经突起簇和淀粉样斑光密度均高于对照组。(5)与对照组相比,9、11和14月龄癫痫小鼠齿状回分子层、颗粒细胞层和苔藓纤维终末p-tau染色增强,而在CA1区p-tau产物减少。(6)9、11和14月龄癫痫小鼠CA1、CA3区和梨状皮质出现细胞丢失和NeuN免疫反应下降。总结与结论：和对照转基因动物相比,匹罗卡品诱导的慢性癫痫3×Tg-AD小鼠边缘系统部分区域出现更早和更严重的淀粉样斑病变和神经元内磷酸化tau表达。癫痫3XTg-AD小鼠脑内这两种AD样病变与神经元损伤和死亡存在区域性相关。BACE1过表达是慢性癫痫动物受损伤脑区轴突芽生及失营养性变的内在信号分子变化之一,可能是加快淀粉斑病变关键因素。
【作者】严小新；
【导师】罗学港；
【作者基本信息】中南大学，神经生物学，2013，博士
【关键词】共病；脑老化；颞叶癫痫；阿尔茨海默病；老年性痴呆；老年斑；淀粉样斑；淀粉样蛋白；贝塔分泌酶；转基因AD模型；神经原纤维缠结；tau蛋白磷酸化；轴突病变；轴突芽生；匹罗卡品癫痫模型；失营养性神经突起；神经退行性疾病；神经塑形；突触功能障碍；抗淀粉样病变治疗；

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