暗饲养对视神经横断SD大鼠视网膜内层局部环路的影响

【摘要】第一章SD大鼠单纯视神经横断模型的解剖学基础目的探究视网膜中央动脉与视神经的关系,为建立稳定可靠的SD大鼠视神经横断损伤动物模型提供解剖学依据。方法采用红色乳胶灌注技术显示正常SD大鼠视神经周边血管,体视显微镜下解剖分离眼动脉、视网膜中央动脉等,观测视网膜中央动脉的来源、分支、走行及其与视神经的关系；根据测量结果在距眼球后极2.0mm(n=6)、5.0mm(n=6)及6.0mm(n=6)处分别于鞘内和鞘外横断视神经,采用明胶墨汁灌注技术显示不同部位视神经横断SD大鼠视网膜的血供,以评估不同部位横断视神经对视网膜血供的影响。结果正常SD大鼠视神经周边血管均被红色乳胶充分灌注而清晰显示,眼动脉位于视神经的外侧,由颈内动脉发出后朝前上内绕过视神经,并在视神经干上方发出分支,包括视网膜中央动脉及内、外睫状动脉等。视网膜中央动脉是眼动脉最主要分支,其起点至眼球后极的距离为(5.784±0.054)mm。视网膜中央动脉绕到视神经内侧后,通过疏松结缔组织与视神经鞘紧贴在一起,在视神经鞘内伴视神经干向前内下走行。于眼球后极位置分出四条分支滋养眼球壁,主干穿眼球壁进入视网膜,发出终支营养视网膜。明胶墨汁灌注结果显示,距眼球后极6.0mm处鞘内横断视神经组SD大鼠视网膜上单位面积主干血管数目高于其他部位视神经横断组。结论SD大鼠视网膜中央动脉始终与视神经伴行于视神经鞘内。制备SD大鼠视神经横断损伤动物模型时,距眼球后极6.0mm处鞘内横断视神经最佳。第二章暗饲养对视神经横断大鼠视网膜内层结构的保护作用目的探讨暗饲养对视神经横断大鼠视网膜双极细胞、节细胞、多巴胺能无长突细胞及其突触联系等的作用和影响。方法实验动物分为正常组、假手术组及视神经横断组,各组动物依随机分为两半,一半常规饲养,一半暗饲养。通过Nissl染色方法观测不同饲养条件下实验各组SD大鼠视网膜的层次结构及节细胞形态结构与数目的改变；用免疫组化方法检测不同饲养条件下各组动物视网膜双极细胞恢复蛋白(Recoverin)、Alpha蛋白激酶(PKC-a)、无长突细胞络氨酸羟化酶(TH)的表达与变化；并运用WesternBlot方法检测各组动物视网膜TH蛋白质水平的表达。结果1.Nissl染色结果：常规饲养组SD大鼠视网膜内核层、外核层及节细胞层的结构排列在3d组开始出现紊乱,至14d组时,除了结构排列紊乱,视网膜层次明显变薄,单位面积视网膜节细胞数目在7d组、14d组明显减少；暗饲养组大鼠视网膜各层结构排列紊乱发生始于5d组,与常规饲养组相比时间有所延迟,单位面积视网膜节细胞数目减少始于14d组。2.PKC-a免疫荧光染色结果：PKC-a表达于双极细胞胞体及突起上。视神经横断后常规饲养大鼠视网膜中双极细胞胞体PKC-a的表达在3d组增强且高于正常组,在5d组、7d组回调到正常水平,14d组表达下降,未见PKC-a在胞体表达,但在内网层的突触上有表达；暗饲养各组视网膜中双极细胞胞体PKC-a的表达与正常组相似,但14d组表达下调,未见PKC-a在胞体表达,在内网层的突触有表达。3.Recoverin免疫组化染色结果：视神经横断后常规饲养的各组大鼠视网膜中,1d组的Recoverin表达上调,且高于正常水平,3d组表达下调到正常水平以下,5d组回调至正常水平,14d组Recoverin表达再下调。暗饲养1d组大鼠视网膜中双极细胞Recoverin表达上调,且高于正常水平；3d组表达回调到正常水平,5d组、7d组大鼠视网膜中双极细胞Recoverin表达与正常组一致,14d组Recoverin表达明显下调且低于正常水平。Recoverin免疫阳性面积在视神经横断后3d暗饲养组明显高于常规饲养组。4.TH免疫组化和WesternBlot结果：常规饲养条件下,视网膜上TH表达1d组、3d组、5d组逐渐下调,5d组达最低值,而7d组TH表达回调到正常水平；暗饲养条件下视网膜TH表达1d组下调,3d组开始回调,5d组回调至正常水平。WesternBlot结果与免疫组化结果基本一致。5.TH和PKC-a荧光双标检测结果：视神经横断后无长突细胞与双极细胞的突触联系逐渐减少,5d组最低、14d组稍有恢复,但远未恢复到正常水平。暗饲养条件下的5d组、14d组视网膜TH和PKC-a共表达的突触数均高于同一时间点的常规饲养条件下各组。结论：暗饲养对视神经横断后SD大鼠视网膜双极细胞、节细胞和DA能无长突细胞以及其突触联系等有保护作用。第三章暗饲养保护ONT大鼠视网膜内层局部环路结构的可能机制目的通过比较不同饲养条件下ONT大鼠视网膜GAD67、BDNF及其受体trkB的表达,分析其与视网膜视觉通路神经元结构功能改变的关系,探讨暗饲养对视神经横断后SD大鼠视网膜双极细胞、节细胞和DA能无长突细胞以及其突触联系等保护作用的可能机制。方法与第二章一样,实验动物分为正常组、假手术组及视神经横断组,各组动物按饲养条件随机分为两半,一半常规饲养,一半暗饲养。根据第一章实验结果制备SD大鼠视神经横断动物模型,用免疫组化染色方法分析不同饲养条件下视神经横断大鼠视网膜上谷氨酸脱羧酶(GAD)、BDNF及其受体trkB等的表达和变化。结果1.GAD67免疫组化结果：常规饲养条件下,视神经横断后GAD67的表达于1d组开始上调,3d组上调达峰值,5d组表达下调。与常规饲养条件下相同时间点比较,暗饲养条件下1d组、3d组GAD67的表达水平均高于常规饲养条件下同一时间点实验组。2.BDNF免疫组化结果：常规饲养条件下,视神经横断后各组SD大鼠视网膜BDNF阳性表达自3d组起逐渐减弱,BDNF阳性节细胞数目逐渐减少。暗饲养条件下,视神经横断后各组SD大鼠视网膜BDNF阳性表达自7d组开始逐渐减弱。3.trkB免疫组化结果：常规饲养条件下,视神经横断后实验各组SD大鼠视网膜trkB免疫阳性表达1d组上调超过正常水平,3d组下表达调,且远低于正常水平,以后各实验组逐渐回调,但仍低于正常水平；暗饲养条件下,实验各组SD大鼠视网膜trkB免疫阳性表达在1d组上调,3D组回调至正常水平。从3d组起暗饲养条件下各组大鼠视网膜trkB免疫阳性面积大于同一时间点常规饲养条件下各组。结论暗饲养条件下,视神经横断后SD大鼠视网膜上GAD67、BDNF、trkB等表达上调,通过增加GABA的合成和分泌,减少BDNF耗竭,增强trkB的活性,从而发挥对视神经横断后SD大鼠视网膜局部环路的保护作用。图17幅,表8个,参考文献139篇
【作者】万炜；
【导师】罗学港；
【作者基本信息】中南大学，生物学，2013，博士
【关键词】SD大鼠；视神经横断；视网膜中央动脉；明胶墨汁；红色乳胶；Nissl染色；Recoverin；PKC-α；TH；双极细胞；节细胞；暗饲养；无长突细胞；视网膜局部环路；

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