JAK2/STAT3信号通路对神经病理性疼痛机制及干预的影响

【摘要】背景及目的神经病理性疼痛是由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛。因其机制复杂,临床上尚无治疗方法可完全治愈。神经系统损伤后,炎症因子的激活及炎症介质的释放不可避免,导致炎症反应的发生。过度的炎症反应会激活伤害性刺激神经元,改变其敏感性,参与神经可塑性的形成,进而导致神经病理性疼痛的发生。JAK(Januskinase,JAK)/STAT(Signaltransducersandactivatorsoftranscription,STAT)信号通路是近年来发现的一条由细胞因子激活的信号传导通路。JAK/STAT通路是中枢神经系统介导炎症和免疫反应的关键信号传导通路。在突触可塑性、神经退行性变,记忆形成占有重要作用。细胞因子与相应的受体结合可导致信号传导通路的活化,将细胞因子的信号由胞膜传到胞浆最终传至胞核,引起目的基因的表达。细胞因子信号抑制因子(suppressorsofcytokinesignaling,SOCS)是一类对细胞因子和生长相关因子信号转导通路起负性调节的蛋白家族,对JAK/STAT信号传导通路发挥负反馈调节作用,参与抑制炎症及凋亡等保护作用。但是JAK/STAT信号通路在神经病理性疼痛形成中的详细机制尚不明确。我们前期研究结果表明双侧坐骨神经结扎(bilateralchronicconstrictioninjury,bCCI)大鼠脊髓背角神经组织大鼠编码为203的小RNA(Rattusnorvegicus-micro-RNA-203,mo-miR-203)的表达水平较假手术组及正常组均明显降低(分别为9倍与10倍)。根据文献报道,miR-203可以抑制SOCS3的表达。因此本研究希望通过结扎大鼠双侧坐骨神经复制bCCI模型,观察JAK2/STAT3通路的活化情况及JAK2/STAT3通路抑制剂WP1066对神经病理性疼痛的影响,研究其分子机制；利用体内miR-203过表达评估其对神经病理性疼痛大鼠疼痛行为学的作用。方法1.验证bCCI神经病理性疼痛大鼠JAK2/STAT3通路的活化情况60只体重180-200gSD雌性大鼠随机分为3组,Naive组,Sham组及bCCI组。Naive组为正常SD大鼠,不做干预。Sham组仅做双侧坐骨神经的暴露,不结扎。bCCI组做双侧坐骨神经结扎手术。分别于术前1d、术后3、7、14和21d测量大鼠对机械刺激、热刺激及丙酮冷刺激的反应并取术后3、7、14和21d三组大鼠I4-L6腰膨大脊髓背角,进行RT-PCR及Westernblot观察JAK/STAT通路中JAK2,STAT3及SOCS3的mRNA水平及蛋白水平的变化。通过免疫组化对JAK2,STAT3及SOCS3进行定位诊断。2.JAK2/STAT3抑制剂WP1066对神经病理性疼痛的影响及其分子机制18只体重180-200gSD雌性大鼠随机分为三组,WP1066组及DMSO组及W-N组。WP1066组及DMSO组分别于bCCI术前,手术当天、术后3天,术后5天经鞘内管给予WP1066(10μl,10mmol/L融入DMSO)或同等容量的DMSO;W-N组为仅做鞘内置管的正常大鼠,干预与WP1066组相同。分别于bCCI手术术前,术后3、5、7、10、14天测量大鼠对机械刺激及丙酮冷刺激的反应。大鼠于术后14天处死,取L4-L6腰膨大脊髓背角进行RT-PCR及Westernblot,观察JAK2,STAT3及SOCS3的mRNA水平及蛋白水平的变化。3.体内miR-203过表达对神经病理性疼痛大鼠疼痛行为学的影响构建mo-miR-203过表达慢病毒载体及阴性对照载体。6只SD大鼠分别进行鞘内置管,随机分为rno-miR-203(+)组及rno-miR-203(-)组。并于bCCI术前,术后三天分别给予mo-miR-203慢病毒过表达载体(10μl,4E+8TU/mL)及阴性对照10μ1。分别观察bCCI术前、术后3、5、7、1O、14天对机械刺激、热刺激及冷刺激的行为学的变化。并于术后14天取LA～6脊髓背角行免疫荧光及RT-PCR反应,验证mo-miR-203的表达。结果1.bCCI组大鼠与Sham组及Naive组相比,机械刺激、热刺激、冷刺激从第7天开始,差异出现统计学意义(P<0.05),表现为阈值明显降低。与Sham组及Naive相比,bCCI组JAK2、STAT3、SOCS3mRNA水平显著升高,3组在不同时间点具有差异(P<0.05)。与Sham组及Naive相比,bCCI组JAK2、P-STAT3和SOCS3蛋白水平升高。以IBA1为小胶质细胞的标记物,免疫组化表明JAK2、STAT3、SOCS3在小胶质细胞中有表达。2.与DMSO组相比,WP1066组机械刺激从第3天开始,热刺激及冷刺激从bCCI术后第5天开始,差异出现统计学意义(P<0.05)。WP1066组出现与W-N组类似变化,两组比较无统计学差异。WP1066试验组与DMSO组相比,不管在mRNA水平还是蛋白质水平,JAK、STAT3及SOCS3均降低,并具有统计学意义。3.利用鞘内注射局部慢病毒表达载体,结果显示与rno-miR-203(-)组相比,rno-miR-203(+)组大鼠机械刺激、热刺激、冷刺激从第7天开始痛阈开始明显升高并出现统计学意义(P<0.05)。rno-miR-203的表达经免疫荧光定性,经RT-PCR定量,与mo-miR-203(-)组相比,rno-miR-203(+)组mo-miR-203表达水平升高,说明鞘内注射慢病毒载体后大鼠脊髓背角mo-miR-203水平升高。结论1.在大鼠bCCI神经病理性疼痛模型发现JAK2/STAT3通路的活化。2.WP1066可通过抑制JAK2/STAT3通路,一定程度上改善bCCI神经病理性疼痛大鼠疼痛行为学。3.利用鞘内注射局部慢病毒表达载体,研究表明局部改变rno-miR-203的表达可改善神经病理性疼痛大鼠疼痛行为学。
【作者】薛照静；
【导师】黄宇光；
【作者基本信息】北京协和医学院，麻醉学（专业学位），2014，博士
【关键词】神经病理性疼痛；JAK/STAT；WP1066；bCCI；miR-203；

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