华南地区鱼类病原哈维氏弧菌分型及其防治策略研究

【摘要】2011年5月～2013年10月,对海南、广东、广西等华南地区的主要海水养殖系统的斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)、红鳍笛鲷(Lutjanuserythopterus)、褐点石斑鱼(E.fuscoguttatus)和珍珠龙胆(棕点石斑鱼E.fuscoguttatus♀×鞍带石斑鱼E.lanceolatus♂)等多种海水鱼类的弧菌病开展了流行病学调查,共分离获得63株弧菌,其中,哈维氏弧菌(Vibrioharcveyi)43株、溶藻弧菌(V.alginolyticus)7株、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)5株、轮虫弧菌(V.rotiferianus)2株、需钠弧菌(V.natriegens)1株、无法确定的弧菌属(UnculturedVibrios)其它种细菌5株；当水体盐度为30时,18株哈维氏弧菌、1株溶藻弧菌、1株轮虫弧菌、1株无法确定的弧菌属其它种细菌均可使斜带石斑鱼致病,其中GDH11385、GDH11387、GDH12388、GDH13389为强毒株(感染24h内出现发病死亡),LD50值分别为4.06×102CFU/g、2.65×103CFU/g、1.06×103CFU/g、1.30×103CFU/g,其余毒力菌株均为弱毒株(感染24h后出现发病死亡)。采用分子生物学方法、表型方法和抗药谱法对分离菌株作了深入的鉴定与分型结果表明,43株细菌的16SrDNA与哈维氏弧菌具有高同源性(99%),且可分为4类,其中,北海市西村港、文昌市铺前镇基本各自聚为一支,其他地区的菌株则分散在这四类中；43株细菌的topA和mreB与哈维氏弧菌具有最高的同源性,分别为96%～99%,且可分为3类,其中,西村港基本聚为一支,其他地区的菌株则分散在这三类中；强毒株GDH11385、GDH11387、GDH12388、GDH13389的rpoA和pyrH都与哈维氏弧菌具有高同源性(99%)。这43株弧菌的表型也与哈维氏弧菌标准菌株基本一致,共分为4类,其中西村港菌株基本聚为一支,其他地区的菌株则分散在另三类中；大部分菌株仅对强力霉素、头孢噻吩、先锋必/舒巴坦、氧氟沙星和利福平等5种抗菌药物敏感,这些菌株也可分为4类,每一类包括一个来源地的绝大多数菌株,新村港来源地的菌株分散于这4类中；因此,由哈维氏弧菌引发的流行病已成为当前华南地区海水鱼的主要细菌性疾病之一,且仅几种用于人类疾病治疗的重要化学药物才能控制该病原,防治风险较高。采用血平板和海水牛奶琼脂平板法测定了43株哈维氏弧菌的溶血性及胞外蛋白酶活性,结果表明,有毒株GDH11385、GDH11387、GXH11001、GXH11003、GXH12001、GXH11004具有溶血圈,无毒株GXH11002、GXH12002、GXH13001、GXH13002、GXH13004、WCH11D222、WCH12D251也具有溶血圈；除了无毒株GXH13005和WCH12D251具有蛋白酶活性外,其余41株细菌均无蛋白酶水解圈。因此,这43株菌株毒性的有无与其溶血性的类型以及其在海水牛奶琼脂平板上的胞外蛋白酶活性大小并无直接关系。采用浸泡法测定了盐度对GDH11385(毒力最强)毒力的影响,试验周期为15d。当盐度为35、30、25、20时,鱼体死亡率为100%；当盐度为15时,死亡率为33.3%；当盐度为10、5时,死亡率为O。同时,还测定了GDH11385在不同盐度水体中的生存情况。在盐度为5、10、15的水体中,4d内活菌浓度从107CFU/mL急剧下降至105CFU/mL；在盐度为20的水体中,4d内活菌的浓度从107CFU/mL下降至106CFU/mL。因此,由哈维氏弧菌的毒力与水体中的盐度具有明显相关性,这对今后运用淡化养殖模式来防治海水鱼类哈维氏弧菌病提供了可靠依据。选取与GDH11385亲缘关系最近的无毒菌株GXH13002作为候选疫苗接种斜带石斑鱼,15d后,当水体中GDH11385终浓度为103CFU/m1、104CFU/ml时,免疫组的死亡率为0,未免疫组的死亡率分别为(20.9±4.2)%、(33.4±8.4)%；当终浓度为105CFU/ml时,免疫组的死亡率为(37.5±4.2)%,最早死亡时间在第7d,未免疫组的死亡率为(62.5±4.2)%,且最早死亡时间提前至第2d；当终浓度为106CFU/ml时,免疫组的死亡率为100%,最早死亡时间在第4d,未免疫组的死亡率也为100%,但是最早死亡时间提前至24h。因此,用无毒株免疫能明显提高养殖动物的抵抗哈维氏弧菌病原的能力,这为今后细菌性病原免疫保护策略开辟了一条新路径。因此,本研究结果表明,当前华南地区海水养殖鱼类中的哈维氏弧菌病原具有毒性大、耐药性强、可侵染多种宿主的特点。在还无法确定哈维氏弧菌病原致病机理及化学防治效果不理想的情况下,采取淡化养殖水体盐度、接种与强毒株亲缘关系较近的无毒株进行免疫保护,是目前防治该地区水产养殖动物哈维氏弧菌病的有效手段。
【作者】崔婧；
【导师】冯永勤；谢珍玉；
【作者基本信息】海南大学，水产养殖，2014，硕士
【关键词】哈维氏弧菌；分子鉴定；分型；人工感染；

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