联合基因Survivin、CDK1的shRNAs靶向干扰对鼻咽癌CNE-2细胞增殖、凋亡的影响

【摘要】目的：构建具有干扰效应的靶向Survivin和CDK1基因及两者串联的短发夹样RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达载体,并研究其对鼻咽癌细胞CNE-2干扰后,癌细胞的生物学行为(增殖、凋亡)的改变。方法：根据Genbank记录的Survivin及CDK1序列,遵循shRNA设计原则并合成相应的寡核苷酸链SurvivinshRNA、CDK1shRNA’构建pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA重组载体,用脂质体Lipofectamine2000方法将其转染入CNE-2细胞株中,RT-PCR初步筛选具有干扰效应的pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA;将上述具有干扰效应的SurvivinshRNA和CDK1shRNA串联进行pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA表达载体的构建,经酶切及测序鉴定后,以脂质体Lipofectamine2000转染CNE-2细胞株后；收集转染单基因及联合基因重组质粒的CNE-2细胞,进行逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测癌细胞Survivin和CDK1的mRNA表达水平,Westernblot检测Survivin和CDK1蛋白表达的变化,噻唑蓝溴化四唑(]methylthiazolyltetrazolium,MTT)法检测癌细胞增殖活性的变化,流式细胞仪检测癌细胞凋亡的变化。结果：(1)经酶切及测序结果分析：pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA重组载体均成功构建；(2)RT-qPCR的结果显示：pU6-SurvivinshRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA各干扰组均下调SurvivinmRNA的表达,分别为52.7%和82.4%,pU6-CDK1shRNA干扰组的SurvivinmRNA的表达没有下调；pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1ShRNA各干扰组均下调CDK1mRNA的表达,分别为56.7%和85.0%,pU6-SurvivinshRNA干扰组的CDK1mRNA的表达没有下调；(3)pU6-SurvivinshRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA干扰组均下调Survivin蛋白的表达,pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA干扰组均下调CDK1蛋白的表达。(4)MTT法检测癌细胞增殖活性的结果显示：pU6-Survivin,hRNA、PU6-CDKlshRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA干扰组均能抑制细胞的生长,抑制率分别为25.60%、15.62%和32.54%；(5)流式细胞仪检测癌细胞凋亡的结果显示：pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA干扰组均促进癌细胞凋亡,凋亡率分别为10.27%,8.00%和14.87%。结论：(1)pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA重组载体均成功构建；(2)pU6-SurvivinShRNA、pU6-CDK1ShRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA重组载体干扰鼻咽癌细胞,均可以抑制癌细胞的增殖,促进癌细胞的凋亡；(3)Survivin基因和CDK1基因有望成为鼻咽癌肿瘤基因治疗的靶基因,多基因联合干扰可以提高效应。
【作者】陈淑萍；
【导师】符生苗；
【作者基本信息】海南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】shRNA；Survivin基因；CDK1基因；鼻咽癌；CNE-2；

【参考文献】
[1]薛平.石城县烟叶生产发展及其产业体系规划[D].江西农业大学,农村与区域发展,2011,硕士.
[2]陈震聃.政策网络结构与公共政策效能分析[D].浙江工商大学,行政管理,2013,硕士.
[3]彭尽晖.檵木芽变生物学特性及离体培养研究[D].湖南农业大学,植物学,2004,硕士.
[4]杨寅寅.南京都市类报纸品牌形象对比分析[D].南京师范大学,新闻学,2012,硕士.
[5]邬向阳.商业银行信贷管理系统的设计与实现[J].中国金融电脑,2001,06:17-21.
[6]艾畅.马尾松无性系种子园遗传多样性及其自由授粉子代父本组成研究[D].南京林业大学,林木遗传育种,2004,硕士.
[7]张雪莲.分散液液微萃取在果汁中农药残留检测中的应用研究[D].西南大学,农产品加工及贮藏工程,2013,硕士.
[8]安海英张玉垒.打造魅力城区[N].唐山劳动日报,2014-07-22001.
[9]和延立.基于Agent的制造系统集成[D].西北工业大学,2002.
[10]李军.马克思技术思想发展史视域下技术的控制与解放[D].哈尔滨理工大学,马克思主义发展史,2012,硕士.
[11]杨家田.基于Sagnac效应的光缆识别仪的设计与实现[D].北京交通大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[12]阮烨.中小企业国际化成长模式及对策研究[D].湖南科技大学,工商管理,2013,硕士.
[13]孙大巍.庆安制冷股份有限公司薪酬体系设计[D].西安科技大学,工业工程,2013,硕士.
[14]娜仁其其格.红花的化学成分研究[D].内蒙古大学,植物学,2014,硕士.
[15]杜豫川,孙立军.高速公路全寿命管理系统研究[J].中国公路学报,2001,S1:50-55.
[16]范瑞祥,马亮,罗安,刘定国.背景谐波电压对混合型有源滤波器的影响及对策[J].电力系统自动化,2008,01:98-102.
[17]朱亮.北京市停车需求预测与公共停车设施规划的研究[D].北京交通大学,2007.
[18]本报记者彭友.南江集团石墨烯概念“通吃”四公司[N].经济观察报,2013-03-04021.
[19]侯建革.四种微孢子虫差异蛋白组学分析及NbSwp7原核表达[D].江苏科技大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[20]聂笃伟.超越负载工况下汽车起重机起升机构负载控制方法的研究[D].湖南大学,机械工程,2013,硕士.
[21]廖巍,刘新喜.三峡库区滑坡稳定性评价研究[J].中国安全科学学报.2004(09)
[22]邱深山,邓飞其,刘永清.Hopfield-型网络求解优化问题的一般演化规则[J].自动化学报,2004,04:507-515.
[23]杨静.张家界国家森林公园旅游供给系统结构优化研究[D].湘潭大学,旅游管理,2012,硕士.
[24]曹彬.潍坊地区地下水源热泵应用的影响及适宜性分区研究[D].济南大学,水文学及水资源,2012,硕士.
[25]张鸣.连接刚体及人体姿态估计的理论与方法[D].上海交通大学,2011.
[26]杨越岚.中学生道德认识能力及其培养研究[D].河北师范大学,思想政治教育,2014,硕士.
[27]白帆.硅纳米线阵列的可控制备及新型异质结太阳电池研究[D].哈尔滨工业大学,2014.
[28]韩琳琳.普西在哈佛大学的治校实践述评[D].河北大学,教育史,2014,硕士.
[29]王婷.论我国刑事简易程序的适用范围[D].华中师范大学,法律,2013,硕士.
[30]石瑞红.器官型海马脑片水平抑制蛋白酶体的活性对tau蛋白代谢的影响及其机制研究[D].华中师范大学,动物学,2012,硕士.
[31]王云波,李洪革,沈亚,李想,王光华,谭伟.阿尔金山山前带东段构造特征与油气成藏的关系[J].石油地球物理勘探,2015,01:156-161+19.
[32]张超.氧化锡锑透明隔热涂层材料的制备研究[D].浙江大学,材料科学与工程,2014,硕士.
[33]王旖冰.公选考试制度与科举制比较研究[D].西北大学,行政管理,2014,硕士.
[34]王志松.两汉军事训练研究[D].河北师范大学,中国古代史,2013,硕士.
[35]张玉巾,彭洪尚,黄世华,由芳田.掺杂香豆素6的杂化纳米颗粒的制备及荧光性能研究(英文)[J].发光学报,2013,12:1555-1560.
[36]殷守革.转户进城农民社会保障路径探究[D].西南政法大学,宪法学与行政法学,2012,硕士.
[37]杨冲.临沂市城区雨水资源化利用模式研究[D].山东大学,水利工程（专业学位）,2013,硕士.
[38]水黎明.高脂血症遗传与环境影响因素分子流行病学研究[D].浙江大学,2002.
[39]杨峰,卞军,何飞雄,蔺海兰,王刚,周强,李丝丝,胡文梅,鲁云.PP/PP-g-MAH/GS–EDA纳米复合材料的制备及性能[J].工程塑料应用,2014,09:10-15.
[40]曾宝国.基于WSN的水产养殖水质实时监测系统研究[D].西南交通大学,计算机技术,2013,硕士.
[41]额尔敦达古拉.浅析牧区中小学家长陪读现象成因及其影响[D].内蒙古师范大学,社会工作（专业学位）,2012,硕士.
[42]马强.基于布尔模型和扩展布尔模型的中文信息检索系统[D].辽宁科技大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[43]陈双.唐太宗的人才管理思想[D].辽宁科技大学,企业管理,2012,硕士.
[44]王乐.油页岩电加热裂解过程中温度场分布的试验与数值模拟[D].吉林大学,地质工程,2014,硕士.
[45]徐昕.我国农村居民消费需求现状及其解决对策[D].辽宁师范大学,政治经济学,2003,硕士.
[46]章谷雅.法人犯罪的刑事责任及其立法完善[D].四川大学,法律,2003,硕士.
[47]李玉彩.沉淀聚合中聚合物微球成球条件的探讨[D].济南大学,高分子化学与物理,2012,硕士.
[48]汪宽福.小菜蛾hsp70基因的克隆及其在抗、敏品系中热激表达差异研究[D].福建农林大学,生物化学与分子生物学,2010,硕士.
[49]付玉华.青岛市农村城市化发展与对策研究[D].浙江大学,建筑与土木工程,2004,硕士.
[50]马学敏.当代大学生和谐人格构建的价值思考及策略研究[D].河北师范大学,思想政治教育,2012,硕士.