血浆Polyphosphate定量检测方法及临床意义的初步研究

【摘要】背景与目的聚磷酸(polyphosphate,polyP)是正磷酸单体通过高能磷酸键连接而成的线性聚合物,几乎存在于所有的生物细胞中。人血小板致密颗粒和病原微生物中也富含polyP。PolyP体外具有显著的促凝、促炎效应,是血小板、病原微生物参与人体血栓形成、炎症反应的一条潜在的新机制。目前,还没有一种简单易行又稳定可靠的血浆polyP提取、定量检测方法。虽已报道血浆中含约6μg/mlpolyP,但血浆polyP的临床病理意义还没有相关文献报道,国内也还没有血浆polyP的相关研究。基于以上现状,本研究旨在1.探索一种简单易行、稳定可靠的血浆polyp提取、定量检测方法；2.检测感染和血栓形成患者的血浆polyP水平,初步了解炎症、血栓形成这两种病理生理过程时人血浆中polyP含量的变化。方法建立并采用DAPI荧光检测法用于polyP的定量检测；检测血浆、血浆组分的荧光信号干扰,分析DAPI荧光检测法能否直接检测血浆polyP含量；采用Martin提取法、glassmilk提取法为基础的各提取方案分离提取加入polyP标准品的血浆探讨这些方案分离提取血浆polyP的效果,并检测提取过程中产生的各组分荧光信号以分析所加polyP标准品的去向；采用已经确定可靠的Lorenz提取法结合简单快速的DAPI荧光检测法检测感染、静脉血栓形成患者的血浆polyP水平。结果Tris缓冲溶液中,DAPI-polyP荧光信号在DAPI浓度5μtg/ml时达到峰值,DAPI-polyP荧光信号在polyP0.05-0.8μg/ml浓度范围内与polyP浓度成线性关系(P<0.01)。含0.8μgpolyP标准品的DAPI染色溶液中,无肝素组(7.014±0.156)与肝素组(16.69±0.964)荧光值具有显著差异(P<0.01)；无枸橼酸组(7.014±0.156)与枸橼酸组(6.915+0.224)荧光值无显著数值上差异和统计学差异(P>0.05)。含06μgpolyP标准品的DAPI染色溶液中,无SDS组(5.666±0.115)与SDS组(18.187+0.691)荧光值具有显著差异(P<0.01)；无白蛋白组(5.666±0.115)与白蛋白组(5.464±0.0862)荧光值无显著差异(P>0.05)；无血浆组(5.6’66±0.115)与血浆组(5.469±0.018)荧光值具有统计学差异(P<0.05)。基于Martin提取法的各提取方案中,SDS+煮沸+核酸酶+PK方案、煮沸+核酸酶+PK方案、煮沸+PK方案的0.6μgpolyP标准品组与无polyP标准品组荧光值有统计学差异(P<0.05)；煮沸+核酸酶+PK+煮沸方案的0.6μgpolyP标准品组与无polyP标准品组之间无显著差异(P>0.05)。煮沸+核酸酶+PK方案、煮沸+PK方案polyP提取率仅为5.7%和2.8%。提取过程中产生的各种组分中,仅在弃去的蛋白沉淀中检测到低水平的polyP荧光信号。基于Glassmilk提取法的各方案中,SDS+7″,醇+glassmilk方案、SDS+glassmilk方案、glassmilk方案的0.6μgpolyP标准品组与无polyP标准品组荧光值均无显著差异(P>0.05),6μgpolyP标准品组与无polyP标准品组同样均无显著差异(P>0.05)。提取过程中产生的各组分中,仅glassmilk吸附后弃液中检测到高水平的polyP荧光信号。感染组血浆polyP水平15.301士6.106,与正常对照组(3.939±1.112)有显著差异(P<0.05)；静脉血栓形成组血浆polyP水平3.841±1.575,与正常对照组(3.939±1.112)无显著差异(P>0.05)。结论1.肝素、SDS会干扰DAPI荧光检测polyP,实验过程中时应避免使用,可使用枸橼酸抗凝管采血。2.单独使用DAPI荧光定量检测法还不能检测血浆polyP含量；基于Martin提取和glassmilk提取的提取方法的提取效果目前还不满意。3.可采用Lorenz法先提取血浆polyP后结合DAPI荧光检测法检测血浆polyP含量。4.血浆polyP水平在感染患者中升高,在静脉血栓形成患者中无明显改变。
【作者】杨开泰；
【导师】陈方平；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】聚磷酸(polyphosphate；polyP)；DAPI；血浆polyP；感染；静脉血栓形成；定量检测；

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