MiR-422a在绝经后骨质疏松患者外周血单核细胞中的表达和功能

【摘要】目的：鉴于外周血单核细胞与骨质疏松关系密切,在本研究小组之前已首次报道miR-133a是绝经后骨质疏松症外周血单核细胞中潜在的生物学标志物的基础上,本研究采用微矩阵基因芯片等一系列生物学方法进一步探讨绝经后骨质疏松症患者外周血单核细胞中micoRNA表达谱,寻找可能的生物标志物及其靶基因,并初步观察其生物学功能。材料与方法：1.本研究招募相互匹配的20例白种人绝经后女性,依据骨密度值分为低骨密度和高骨密度组各10例。抽取外周静脉全血,采用密度梯度离心的方法,初步分离获得外周血单个核细胞,紧接着借助抗原抗体结合免疫磁珠法筛选出未接触表面抗体的外周血单核细胞,流式细胞仪检测外周血单核细胞纯度,应用miRNAarray芯片技术,分析获得miRNA差异表达谱,选取差异表达的miRNAs,进一步行逆转录后实时荧光定量PCR验证,得出差异表达基因miR-422a。同时,采用大致相同的方法检测来自相同外周血单个核细胞样本中B淋巴细胞的miR-422a在低骨密度组和高骨密度组的表达水平。2.运用生物信息学方法筛选miR-422a潜在的靶基因,对筛查出的5个潜在靶基因CBL、CD226、IGF-1、PAG1、TOB2运用实时荧光定量PCR检测其实际表达水平,分析与miR-422a表达水平的相互关系。3.利用脂质体转染成熟miR-422a的模拟物或抑制物到正常人外周血单核细胞,初步观察miR-422a在外周血单核细胞诱导分化为破骨样细胞过程中发挥的作用。结果：1.绝经后女性高密度组,腰椎骨密度值为(1.128±0.058)g/cm2,腰椎Z值为(2.24士0.59),髋部骨密度值为(1.057±0.101)g/cm2,髋部Z值为(1.94士0.99)。低密度组腰椎骨密度值为(0.826士0.069)g/cm2,腰椎Z值为(-0.63士0.64),髋部骨密度值为(0.725±0.045)g/cm2,髋部Z值为(-1.04±0.45)。髋部和脊柱骨密度和Z值在高骨密度和低骨密度组之间差异显著(P<0.001).MicroRNA矩阵列分析,对两组20例单核细胞RNA样本中365个miRNA的表达水平测试发现：miR-133a、miR-382差异表达明显,miR-422a、mir-27b、miR-151、miR-152呈统计学临界差异表达水平,且在20例样本中均检测到表达,具体为：miR=133a的表达水平在低骨密度组相比高骨密度组有6.48倍的上调(4.21±2.15vs.0.65±0.75,P=0.007),miR-382的表达水平在低骨密度组相比高骨密度组有3.65倍的上调(2.74±2.18对比0.75±0.63,P=0.027)。此外,还有四个临界差异表达的miRNA分子：miR-422a的(2.91±2.55vs.1.24±0.79,P=0.065).miR-27b(2.48±2.05vs.1.02±0.86,P0.054).miR-151(1.44±0.87vs.0.86±0.42,P=0.076)和miR-152(1.32±0.49vs.0.91±0.47,P=0.076)。在本研究小组之前已经验证miR-133a和miR-382的基础上,继续运用实时荧光定量PCR分别对在矩阵列分析中四个临界差异表达的miRNA分子进一步验证。结果显示：仅miR-422a的表达水平在低骨密度组和高骨密度组之间具有统计学差异(1.31±0.54vs.0.85±0.27,P=0.029)。其他三个miRNA分子的表达水平在低骨密度组和高骨密度组之间无统计学差异。具体结果为：miR-27b(1.26±0.66vs.0.99±0.43,P=0.29).miR-151(1.37±1.08vs.0.98±0.41,P=0.30)和miR-152(1.50±1.11vs.0.95±0.54,P=0.17)。外周血B淋巴细胞中miR-422a的表达水平在低骨密度组和高骨密度组之间无统计学差异(P=0.31)。2.借助生物信息学工具,筛选出CBL、CD226、IGF1、PAG1和TOB2等5个潜在靶基因。RT-qPCR检测显示这5个基因在绝经后女性外周血单核细胞中的表达在低骨密度组与高骨密度组之间没有统计学差异,具体为：CBL(4.82±5.43vs.2.62±3.27,P=0.29).CD226(2.79±5.40vs.2.29±3.72,P=0.81).IGF1(1.22±1.39vs.4.92±6.78,P=0.11).PAG1(2.65±3.78vs.2.88±5.43,P=0.92)和TOB2(1.37±2.44vs.4.96±7.99,P=0.19).miR-422a的与这五个潜在靶基因之间的相关性分析表明：尽管相关性检验没有差异,但是这5个基因和miR-422a的之间均存在负相关性(P>0.05)。3.在单核细胞向破骨样细胞诱导分化的基础上,转染引入成熟miR-422a的模拟物或抑制物,依据干预因素的不同,分为6组,A组(空白对照组)、B组(诱导分化组)、C组(诱导分化+miRNA模拟物阴性对照组)、D组(诱导分化+miRNA模拟物组)、E组(诱导分化+miRNA抑制物阴性对照组)、F组(诱导分化+miRNA抑制物组)。培养至第8天,光学显微镜下观察细胞诱导分化情况,发现各组结果如下：A组(空白对照组)未见破骨样细胞生成；B组(诱导分化组)有一定数量的破骨样细胞；C组(诱导分化+miRNA模拟物阴性对照组)也可见破骨样细胞生成,其数量与B组相比无统计学差异；D组(诱导分化+miRNA模拟物组)可见破骨样细胞生成,其数量与C组(诱导分化+miRNA模拟物阴性对照组)相比明显增加,统计学差异显著；E组(诱导分化+miRNA抑制物阴性对照组)也可见破骨样细胞生成,其数量与B组(诱导分化组)相比无统计学差异；F组(诱导分化+miRNA抑制物组)可见破骨样细胞生成,其数量与E组(诱导分化+miRNA抑制物阴性对照组)相比明显减少,统计学差异显著。结论：1.miR-422a是绝经后骨质疏松症一种潜在的外周血单核细胞特异性生物标志物,在绝经后骨质疏松症的发生发展中可能起着重要作用。2.CBL、CD226、PAG1、TOB2和IGF-1是绝经后骨质疏松症外周血单核细胞中miR-422a作用的潜在靶基因,可为进一步研究miR-422a的作用机制提供参考。3.miR-422a可能在外周血单核细胞向破骨样细胞分化过程中起到正向调节作用,促进破骨样细胞的生成。
【作者】曹政；
【导师】何爱咏；肖涛；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】绝经后骨质疏松；miR-422a；实时荧光定量PCR；转染；

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